氨水诱导的小鼠咳嗽模型

氨水诱导的小鼠咳嗽模型：原理、操作与应用

摘要： 氨水诱导咳嗽模型是一种经典、简便且广泛应用的动物实验模型，主要用于研究咳嗽反射机制、评价镇咳药物的疗效及探索气道高反应性相关疾病病理生理机制。本文详细阐述了该模型的建立方法、评价指标、优缺点及适用范围。

一、 模型原理

氨气（NH₃）是一种水溶性刺激性气体。当小鼠吸入雾化的氨水溶液时，氨气分子迅速溶解于上呼吸道及大气道黏膜表面的粘液中，形成氢氧化铵（NH₄OH），呈现强碱性。这种碱性刺激可直接作用于气道黏膜上的感觉神经末梢（主要是瞬时受体电位香草素亚型1 TRPV1通道和瞬时受体电位锚蛋白亚型1 TRPA1通道），诱发传入神经兴奋性冲动，上传至延髓咳嗽中枢，最终引发咳嗽反射。

二、 模型建立方法

1. 实验动物：

   • 通常选用健康成年小鼠（如昆明种、C57BL/6、BALB/c等）。
   • 体重范围：18-25g。
   • 饲养环境：标准SPF级动物房，自由摄食饮水，实验前适应性饲养至少3天。
   • 伦理要求： 实验方案需经实验动物伦理委员会批准，实验操作遵循动物福利原则，尽量减少动物痛苦。实验结束后实施安乐死。

2. 主要试剂与仪器：

   • 氨水溶液： 分析纯或更高纯度的氨水（浓度通常为25%-35%），用生理盐水稀释至所需浓度（常用浓度范围为：5%-25%，体积比）。
   • 雾化装置： 医用压缩气体雾化器（如压缩空气或氧气驱动），喷出雾粒直径宜在1-5μm以利于沉积于呼吸道。
   • 动物固定装置： 透明有机玻璃雾化箱（体积适中，约1-5L），确保动物在箱内可自由活动但不易逃脱。
   • 计时器： 记录咳嗽潜伏期和咳嗽次数。
   • 生理盐水： 作为阴性对照。
   • 防护装备（实验者）：口罩、手套、护目镜（在通风橱或通风良好环境下操作）。
   • （可选）视频/音频记录设备：用于后续行为学分析。

3. 操作步骤：

   • 准备： 小鼠实验前禁食禁水2-4小时（减少口腔分泌物干扰），称重，编号。
   • 装置连接： 将雾化器与雾化箱连接密封。
   • 对照组： 取一只小鼠放入雾化箱，启动雾化器，喷入生理盐水（或低浓度氨水，如0.5%），持续喷雾一定时间（通常1-5分钟），记录小鼠在喷雾期间及喷雾结束后一段时间内（如5-10分钟）的咳嗽次数和首次咳嗽发生时间（潜伏期）。
   • 模型组 / 给药组：
     • （若评价药物）给药： 提前给予待测镇咳药（灌胃、腹腔注射、吸入等）或阳性对照药（如可待因）。设立空白对照组（溶剂）和阳性药对照组。
     • 诱导咳嗽： 将小鼠放入雾化箱，启动雾化器，喷入设定浓度的氨水溶液（如10%，15%，20%），持续喷雾相同时间（通常1-5分钟）。
     • 观察记录： 由训练有素且对分组信息不知情的研究人员，通过直接观察（或结合视频/音频回放）记录：
       • 咳嗽潜伏期： 从开始喷氨水到出现第一次咳嗽的时间（秒）。
       • 咳嗽次数： 在整个喷雾期间及喷雾结束后设定的观察时间内（如5-10分钟）小鼠发生的咳嗽总次数。小鼠咳嗽的特征性表现为：弓背、张口、头部前伸伴随一次或多次短暂、剧烈的爆发性呼气动作，通常伴有特征性声音。
   • 清洗： 每组实验结束后，彻底清洗、干燥雾化箱和连接管道，避免残留氨气干扰后续实验。
   • 重复： 每组需有足够数量的动物（通常n≥8-10）以保证统计学效力。

4. 浓度与时间选择：

   • 浓度梯度： 通常通过预实验选择合适的氨水浓度。过低浓度可能无法有效诱导足够咳嗽次数；过高浓度（如>25%）可能引起强烈刺激甚至气道损伤、窒息死亡。常用有效诱导浓度为7.5%-20%。
   • 喷雾时间： 通常为1-5分钟。需平衡刺激强度和动物耐受性。观察时间（喷雾后）通常设定为5-10分钟。

三、 评价指标

1. 核心指标：
   • 咳嗽次数： 最直接反映咳嗽反射强度的指标。模型组咳嗽次数显著高于生理盐水对照组。
   • 咳嗽潜伏期： 反映刺激敏感性。模型组潜伏期通常显著短于对照组。
2. 辅助指标（可选）：
   • 刺激期间动物行为变化（如舔鼻子、抓挠面部、躁动不安等）。
   • （若研究气道炎症）实验后取支气管肺泡灌洗液（BALF）分析炎症细胞数量与类型、炎性因子水平；取肺组织进行病理学检查（HE染色观察炎症浸润和组织损伤）。
   • （若研究神经机制）取迷走神经节或相关脑区进行分子生物学（如qPCR检测咳嗽相关受体表达）或免疫组化分析。

四、 模型优缺点

• 优点：
  • 简便易行： 设备要求相对简单，操作便捷，耗时短。
  • 高效稳定： 短时间内可诱导出显著的咳嗽反应，模型成功率高。
  • 成本低廉： 主要试剂（氨水）价格便宜。
  • 应用广泛： 主要用于初筛镇咳药，研究外周感觉神经在咳嗽中的作用。
• 缺点与局限性：
  • 刺激性单一： 主要模拟化学刺激性咳嗽，与临床上更为常见的炎症性咳嗽（如感冒、哮喘、COPD）或多因素引起的慢性咳嗽在机制上有差异。
  • 气道损伤风险： 高浓度氨水可能造成气道黏膜化学性灼伤，引起炎症反应，干扰对单纯咳嗽反射的评价（进行病理检查时需注意区分）。
  • 标准化挑战： 雾化效率、雾粒大小、动物活动状态、观察者主观性等因素可能影响结果稳定性，需严格控制和标准化操作。
  • 种属差异： 啮齿类动物与人类的咳嗽反射通路存在一定差异，实验结果外推需谨慎。

五、 应用范围

1. 镇咳药物筛选与评价： 是初步评价中枢性和外周性镇咳药效力的经典模型。
2. 咳嗽反射机制研究： 研究感觉神经末梢（TRPV1, TRPA1等）在化学刺激性咳嗽中的作用。
3. 气道感觉神经高敏感性研究： 探究神经源性炎症、神经可塑性改变在气道高反应性中的作用（常需结合其他模型或检测）。
4. （需谨慎解读）气道炎症初步观察： 高浓度刺激后可通过BALF和病理检查观察继发性炎症反应。

六、 注意事项

1. 安全防护： 氨水具有挥发性和刺激性，操作务必在通风橱或通风极好的环境下进行，实验人员佩戴好防护装备。
2. 动物福利： 密切观察动物状态，避免使用过高浓度氨水导致剧烈痛苦或死亡。实验过程应尽可能缩短。提供必要镇痛措施（通常短时刺激无需额外镇痛，但若需取材需麻醉）。
3. 标准化操作： 固定雾化箱体积、雾化器流量、喷雾时间、氨水浓度、动物禁食时间、观察环境和观察人员，以减少实验误差。建议使用视频记录以便复核。
4. 设置严格对照： 生理盐水对照组必不可少，以排除雾化操作本身、雾化噪音、环境改变等非特异性因素的影响。
5. 结果解释： 认识到该模型主要反映急性化学刺激性咳嗽，其结论应用于临床时应考虑人体咳嗽的复杂性。

结论：

氨水诱导的小鼠咳嗽模型以其简便、高效、经济的特点，成为咳嗽基础和药物研究领域的重要工具。它为阐明咳嗽外周神经机制和筛选潜在镇咳药物提供了有效平台。然而，研究者应充分认识其模拟化学刺激性咳嗽的局限性，合理设计实验（包括浓度和时间的选择），严格遵守动物伦理规范，并结合其他模型和方法，以更全面地理解复杂的咳嗽病理生理过程和药物作用机制。

参考文献： (此处列出关键参考文献，例如)

1. Karlsson, J. A., Sant'Ambrogio, G., & Widdicombe, J. (1988). Afferent neural pathways in cough and reflex bronchoconstriction. Journal of Applied Physiology, 65(3), 1007–1013.
2. Dicpinigaitis, P. V. (2007). Cough: an unmet clinical need. British Journal of Pharmacology, 150(4), 481–483.
3. 王, 长征等. (2009). 豚鼠和小鼠咳嗽模型的研究进展. 国际呼吸杂志, 29(18), 1126-1129. (请替换为更具体的近期研究文献)
4. Belvisi, M. G., & Geppetti, P. (2004). Cough. 7: Current and future drugs for the treatment of chronic cough. Thorax, 59(5), 438–440. (讨论药物评价)

注意： 本文提供的是该模型的通用描述和方法框架。具体实验设计中，浓度、时间、观察时长等参数需根据研究目的、动物品系和预实验结果进行优化和确定。