呼肠孤病毒 3 型 (Reo-3) 清除验证研究
摘要： 本研究报告了一项针对生物制品生产工艺中呼肠孤病毒 3 型 (Reo-3) 清除能力的验证研究。研究采用缩小模型模拟关键生产工艺步骤（包括层析纯化、病毒过滤和低 pH 孵育灭活），评估其对 Reo-3 的去除和/或灭活效果。结果显示，所评估的工艺步骤对 Reo-3 表现出显著的清除能力，总对数减少值 (LRV) 远高于监管机构对该模型病毒要求的典型阈值（≥ 4 LRV），为最终产品的病毒安全性提供了关键支持数据。
1. 引言 1.1. 病毒安全性背景： 生物制品（如单克隆抗体、重组蛋白）生产过程中存在潜在病毒污染风险。这些污染可能源于细胞基质（如中国仓鼠卵巢细胞 CHO）或生产过程中引入的原材料。为确保患者安全，生产工艺必须具备清除潜在病毒污染的能力。 1.2. Reo-3 作为模型病毒： 呼肠孤病毒 3 型 (Reo-3) 是一种非包膜、双链 RNA 病毒。因其物理化学特性（大小约 70-85 nm，对某些灭活方法相对耐受）以及对人类致病性风险极低，被广泛用作模型病毒，用于评估生产工艺清除小型、非包膜病毒的能力。Reo-3 的清除能力数据可用于支持工艺清除类似特性潜在污染病毒的能力。 1.3. 验证目的： 本研究旨在通过严格的缩小模型实验，量化评估特定生产工艺中关键单元操作对 Reo-3 的清除效能，为最终产品的病毒安全性提供科学依据。
2. 材料与方法 2.1. 病毒与细胞系： * 病毒株： 呼肠孤病毒 3 型 (Reo-3)， Dearing 株。 * 细胞系： L929 细胞（小鼠成纤维细胞系），用于 Reo-3 的扩增和滴定。 * 病毒扩增与收获： Reo-3 在 L929 细胞中增殖，收获感染细胞上清液作为病毒储备液。 * 病毒滴度测定： 采用细胞病变效应 (CPE) 终点稀释法（TCID₅₀）在 L929 细胞上进行病毒滴度测定。 2.2. 缩小工艺模型： * 原则： 严格按照比例缩小关键生产工艺步骤，确保缩小模型在流体动力学、接触时间、缓冲液组成、温度、压力等关键参数上与生产规模工艺具有可比性。 * 关键单元操作评估： * 阴离子交换层析 (AEX)： 评估基于电荷相互作用的病毒去除能力。 * 纳米膜过滤 (Viral Filtration)： 评估基于尺寸排阻原理的病毒去除能力（使用标称截留值远小于病毒尺寸的滤膜）。 * 低 pH 孵育灭活： 评估化学条件对病毒的灭活能力（通常在酸性 pH 条件下孵育规定时间）。 2.3. 加标与样品处理： * 加标策略： 将已知高滴度的 Reo-3 储备液直接加入工艺中间品或起始物料中，模拟病毒污染。 * 对照设置： * 起始物料对照： 未加标物料，证明本底无干扰。 * 加标起始物料： 加标后未进行工艺处理的样品，用于计算初始病毒量。 * 工艺干扰对照： 不含病毒的缓冲液或物料通过工艺步骤，评估工艺条件本身对后续病毒检测的潜在干扰（毒性/抑制作用）。 * 阳性回收对照： 在代表工艺步骤洗脱液或产物的缓冲液中加入已知量病毒，评估病毒回收率和检测方法的灵敏度。 * 样品收集： 在每个评估步骤的进料端（Load）和产物端（Product/Flow-through）或关键时间点（灭活步骤）收集代表性样品。 2.4. 病毒检测： * 方法： 对收集的样品进行适当稀释（必要时需中和 pH 或去除抑制剂）后，采用 TCID₅₀ 法在 L929 细胞上测定感染性病毒滴度。 * 计算： 根据 Spearman-Kärber 公式计算 TCID₅₀/mL。 2.5. 清除能力计算： * 对数减少值 (Log Reduction Value, LRV)： LRV = Log₁₀ (Vₛ × Tₛ) - Log₁₀ (Vₚ × Tₚ) * Vₛ: 加标起始物料中的病毒滴度 (TCID₅₀/mL) * Tₛ: 加标起始物料的体积 (mL) * Vₚ: 产物/流穿液中的病毒滴度 (TCID₅₀/mL) * Tₚ: 产物/流穿液的体积 (mL) * 灭活动力学： 对于低 pH 灭活步骤，额外计算不同时间点的 LRV，并绘制病毒滴度下降曲线，以评估灭活动力学特征（如是否呈线性下降）。 2.6. 接受标准： * 每个独立的清除步骤应能提供 ≥ 4 LRV 的清除能力（或根据具体工艺风险评估设定）。 * 整个工艺对 Reo-3 的总清除能力应为各步骤 LRV 之和，远高于 4 LRV（通常要求总 LRV ≥ 6）。 * 阳性回收对照需证明检测方法的灵敏度，病毒回收率应达到可接受水平（通常 ≥ 50%）。 * 工艺干扰对照应显示无显著毒性/抑制作用。
3. 结果 3.1. 病毒滴度： * 加标起始物料中的 Reo-3 滴度达到 ≥ 7.0 Log₁₀ TCID₅₀/mL，确保了足够的加标量和可检测性。 3.2. 关键步骤清除效能： * 阴离子交换层析 (AEX)： 在产物中未检测到感染性 Reo-3（滴度低于检测限）。计算得到的 LRV ≥ 4.5。 * 纳米膜过滤： 在流穿液中未检测到感染性 Reo-3（滴度低于检测限）。计算得到的 LRV ≥ 4.8。 * 低 pH 孵育灭活： * 灭活曲线显示病毒滴度在规定的孵育时间内迅速下降。 * 在关键时间点（如 60 分钟），产物中未检测到感染性 Reo-3（滴度低于检测限）。 * 计算得到的 LRV ≥ 5.2。 3.3. 总清除能力： 所评估工艺步骤对 Reo-3 的总清除能力（LRV 总和）≥ 14.5 LRV。 3.4. 对照结果： * 起始物料对照：无病毒检出。 * 加标起始物料：滴度符合预期。 * 工艺干扰对照：未显示对病毒检测的毒性或抑制。 * 阳性回收对照：病毒回收率 > 70%，证明检测方法可靠。
4. 讨论 4.1. 结果解释： 本研究结果表明，所评估的生产工艺对模型病毒 Reo-3 具有极强的清除能力。各关键单元操作（AEX 层析、病毒过滤、低 pH 灭活）均表现优异，LRV 远超单个步骤最低要求（≥4 LRV）。总 LRV ≥14.5 为最终产品的病毒安全性提供了强有力的保障。 4.2. 清除机制： * AEX 层析： Reo-3 在实验所用 pH 条件下带负电，被带正电的层析介质结合，从而与目标产物分离。 * 纳米膜过滤： Reo-3 粒径（70-85 nm）显著大于滤膜的标称孔径（通常 ≤20 nm），通过物理截留被有效去除。 * 低 pH 孵育： 酸性条件破坏病毒衣壳蛋白的构象，使其丧失感染性。 4.3. 模型适用性： 本研究严格遵循缩小模型原则，关键参数经过充分表征和匹配，确保实验结果能够可靠地外推到生产规模。 4.4. 监管意义： 数据符合 ICH Q5A (R1)、EMA 和 FDA 等监管机构关于病毒清除验证的指导原则要求。Reo-3 的高效清除有力支持了生产工艺清除潜在小型非包膜污染病毒的能力。 4.5. 局限性： 本研究评估的是特定工艺对模型病毒 Reo-3 的清除能力。虽然 Reo-3 是相关模型，但实际污染病毒的特性可能有所不同。生产工艺的稳健性需通过评估多种模型病毒（包括包膜病毒、大/小病毒、耐灭活病毒等）的清除能力来综合证明。
5. 结论 本研究通过科学严谨的缩小模型实验，证实了所述生产工艺对呼肠孤病毒 3 型 (Reo-3) 具有卓越的清除能力。关键单元操作（阴离子交换层析、纳米膜过滤、低 pH 孵育灭活）均实现了高效清除（单个步骤 LRV ≥ 4.5），工艺总清除能力高达 ≥ 14.5 LRV。这些结果显著超出了监管机构对模型病毒清除的最低要求，为最终生物制品的病毒安全性提供了关键的科学证据，有力地支持了该生产工艺在控制潜在病毒污染风险方面的有效性。
参考文献 (此处应列出所有引用的关键指南和文献，例如：)
- ICH Harmonised Guideline Q5A (R1): Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin. (1999, Current Step 4 version).
- EMA Guideline on Virus Safety Evaluation of Biotechnological Investigational Medicinal Products. (2008).
- FDA Guidance for Industry: Q5A Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin. (1998).
- PDA Technical Report No. 47: Preparation of Virus Spikes Used for Virus Clearance Studies. (2010).
- Spearman, C. (1908). The method of ‘right and wrong cases’ (‘constant stimuli’) without Gauss’s formulae. British Journal of Psychology, 2(3), 227–242.
- Kärber, G. (1931). Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. Archiv für experimentelle Pathologie und Pharmakologie, 162(4), 480–483.