脊髓灰质炎病毒 1 型清除验证 - 中析研究所生物检测中心

脊髓灰质炎病毒1型清除验证：确保生物制品安全性的关键技术

在生物制品（如治疗性蛋白质、单克隆抗体、疫苗等）的生产过程中，潜在的病毒污染始终是需要严格防控的重大安全风险。为了评估和证实生产工艺清除或灭活病毒污染物的能力，病毒清除/灭活验证研究是必不可少的环节。其中，脊髓灰质炎病毒1型（Poliovirus Type 1, PV1） 因其独特的理化特性，被广泛用作模型病毒或指示病毒，特别是在评估生产工艺对小型无包膜病毒清除效能的研究中。

1. PV1作为模型病毒的科学依据

代表性： PV1属于小RNA病毒科肠道病毒属，是无包膜病毒的代表。其结构（二十面体衣壳包裹单股正链RNA基因组）和理化性质（如大小约28-30nm，对物理化学处理相对稳定）使其能够模拟那些可能污染生物制品、难以清除的小型无包膜病毒（如肠病毒、甲肝病毒等）。
安全性： 通过使用减毒株（如Sabin株），在严格控制的安全等级实验室（如BSL-2）中进行操作，风险相对较低。
易培养与检测： PV1可在多种细胞系（如Vero细胞、BGM细胞、HEK293细胞）上高效增殖，并能通过灵敏的方法（如终点稀释法-TCID50、噬斑形成单位-PFU）进行定量检测，便于准确测定病毒滴度的下降幅度。
监管认可： 国际监管机构（如ICH、FDA、EMA）的指南明确推荐使用PV1作为小型无包膜病毒的模型病毒进行清除验证。

2. PV1清除验证的目的

验证研究的核心目标是提供科学证据，证明特定的生产工艺步骤（如层析、过滤、低pH孵育、去污剂处理、巴氏消毒、纳滤等）能够在可控条件下，稳定且显著地降低（清除或灭活）产品中可能存在的病毒载量。使用PV1旨在评估该步骤对小型无包膜病毒的清除效能。

3. PV1清除验证的核心要素

缩小模型的建立：
- 关键性： 必须在代表实际生产规模工艺的缩小模型中进行研究。模型需经过充分验证，证明其关键工艺参数（流速、压力、温度、pH、缓冲液组成、填料/膜类型、料载量、接触时间等）与生产规模保持一致。
- 比例： 缩小比例需合理，确保流体动力学、传质过程等关键因素与生产规模可比。
病毒悬液的制备与表征：
- PV1毒株（通常使用Sabin LSc 2ab株）需在适宜的细胞系中扩增。
- 收获的病毒悬液需进行澄清、浓缩（如超滤离心），并测定初始滴度（通常需达到高滴度，如 ≥10^7 TCID50/mL或PFU/mL）。
- 需评估病毒的均一性和纯度，确保无聚集，避免影响清除效果评估。
- 病毒悬液需在特定条件下（如超低温冷冻）稳定储存并验证其稳定性。
病毒加标（Spiking）：
- 将高滴度的PV1悬液按预定体积比（通常1-5%）加入到待处理的中间品或模拟料液中。
- 加标后需充分混合均匀，并立即取样作为起始样品（Pre-treatment sample）。
- 加标比例需确保在检测方法的线性范围内，同时不能显著改变料液的理化性质（如pH、离子强度、粘度、蛋白浓度），以免干扰工艺步骤本身的性能。
工艺步骤的执行与取样：
- 将加标后的料液严格按照工艺规程和缩小模型的已验证参数运行目标清除步骤。
- 在工艺步骤结束时收集流出液、洗脱液或处理后的料液，作为产物样品（Post-treatment sample）。
- 对于需要时间过程的步骤（如低pH孵育、巴氏消毒），需在设定的关键时间点（如0, 15, 30, 60分钟）取样，以绘制病毒灭活动力学曲线。
样品处理与病毒滴度测定：
- 起始样品和产物样品（及中间时间点样品）需要经过适当的预处理（如稀释、缓冲液置换、中和毒性/抑制作用），以便进行病毒检测。
- 使用经过验证的、灵敏且可靠的检测方法（最常用的是终点稀释细胞病变效应法（TCID50） 或噬斑法（PFU））测定所有样品的残余病毒感染性滴度。
- 检测需设置充分的平行样本和对照（如细胞毒性对照、病毒干扰对照、阳性病毒对照、阴性对照）。
清除因子计算：
- 病毒清除因子（Reduction Factor, RF）是衡量清除效果的核心指标。
- RF = Log10 (起始病毒总量 / 残余病毒总量)
- 起始病毒总量 = 起始样品滴度 (Log10 TCID50/mL或Log10 PFU/mL) × 起始样品体积 (mL)
- 残余病毒总量 = 产物样品滴度 (Log10 TCID50/mL或Log10 PFU/mL) × 产物样品体积 (mL)（对于总体积变化显著的步骤如过滤、层析洗脱峰收集，必须考虑体积变化！）
- 总清除因子（LRV） = Log10 (起始病毒总量 / 残余病毒总量)（等同于RF，但更强调整体清除能力Log Reduction Value）。
接受标准：
- 监管指南一般要求关键病毒清除步骤应能达到显著的清除效果（如RF ≥ 4 Log10，即清除99.99%的病毒）。具体接受标准需根据产品的性质、风险等级、以及工艺中其他清除步骤的累积效果来确定。
- 验证结果必须证明清除效果具有稳健性（Robustness）。通常通过在不同工艺参数设定点（挑战边界条件）下进行重复实验（通常≥3次独立运行）来实现，以证明清除效果在预期操作范围内是一致的、可重现的。

4. 关键考量与挑战

病毒聚集的控制： PV1悬液中的病毒聚集体会显著影响清除效果评估（聚集体可能难以通过过滤孔径或层析填料孔隙），因此在制备、储存和使用过程中必须严格控制并监测病毒聚集状态。
基质效应（Matrix Effects）： 料液组分（如高浓度蛋白质、脂类、盐、洗涤剂等）可能影响病毒的稳定性、清除机制（如干扰病毒与层析填料的结合或滤膜的吸附）或检测灵敏度（毒性或干扰）。验证设计时必须评估并尽可能控制这些效应。
检测方法的灵敏度与变异： 检测方法的检测限（LOD）、定量限（LOQ）和精密度（变异系数CV）直接影响RF计算的准确性和可靠性。病毒滴度测定方法的验证至关重要。
缩小模型的代表性： 这是整个验证的基础。任何缩小模型与生产规模的关键参数不一致，都可能导致验证结果无法外推至实际生产。
统计学考虑： 病毒滴度测定本身存在统计学变异（如基于Poisson分布），在计算RF和评估结果显著性时需要考虑这种不确定性。

5. 结果分析与报告

验证研究报告应详细阐述所有实验设计、执行细节、原始数据和分析结果，包括：

缩小模型建立及代表性验证数据。
PV1病毒悬液的制备、表征和滴度数据。
每次独立运行的加标信息、工艺参数记录。
所有样品的病毒滴度测定原始数据和计算结果（包括平行样本）。
每次运行的清除因子（RF/LRV）计算过程和结果。
多次独立运行结果的汇总（平均值、标准偏差或范围）。
清除效果的统计分析（如适用）。
对结果的讨论，包括任何偏差、局限性、以及清除效果稳健性的评估。
明确的结论：声明该工艺步骤对PV1（代表小型无包膜病毒）的清除能力是否达到预期接受标准。

6. 清除验证的意义与局限性

意义： PV1清除验证是评估生产工艺病毒安全性保障能力不可或缺的环节。它为证明生产工艺能够有效清除类似特性的潜在污染物提供了关键的科学数据，是产品上市注册申请所需的重要资料，也是确保患者用药安全的基础。
局限性：
- 模型替代性： PV1无法完美代表所有潜在的小型无包膜病毒（如不同病毒对特定处理的敏感性可能不同）。
- 病毒载量假设： 验证通常假设存在高水平的病毒污染来挑战工艺，但实际污染水平未知且可能很低。
- 指示意义： 验证结果主要指示工艺的潜力，不能保证实际生产中绝对无菌或无病毒。
- 其他风险： 验证通常针对已知的潜在病毒污染物，无法涵盖未知或新出现病毒的风险。

7. 展望：新技术与替代方法

随着技术进步，一些新的方法和模型病毒也在探索中：

MMV（鼠微小病毒）： 另一种常用的小型无包膜模型病毒（细小病毒科）。
嵌合病毒/假病毒： 将目标病毒的衣壳或关键蛋白与报告基因系统结合，提高检测通量和生物安全性。
下一代测序（NGS）： 用于更广泛地监测产品或细胞基质中的病毒核酸序列。
体外表达系统： 用于制备无感染性的病毒样颗粒（VLPs）进行某些研究。
计算机模拟（In Silico）： 结合病毒和工艺知识进行初步预测（尚不能替代实验验证）。

结论

脊髓灰质炎病毒1型（PV1）清除验证是生物制品病毒安全性保障体系中的一块关键基石。通过精心设计、严格执行和全面分析，该研究为生产工艺清除小型无包膜病毒污染物的效能提供了重要的定量证据。尽管存在模型替代性和其他固有局限性，严格遵守法规指南和科学原则进行的PV1清除验证，结合其他模型病毒的验证结果和全面的病毒安全策略（如严格源头控制、细胞库和外源因子检测），对于最大限度降低生物制品病毒污染风险、确保最终产品的安全性和质量、保护患者健康具有不可替代的核心价值。持续关注新技术的发展并评估其应用潜力，有助于未来进一步提高验证研究的效率和可靠性。