蚯蚓急性毒性试验指南
1. 试验目的 本试验旨在测定化学物质、废弃物或环境样本对蚯蚓的急性致死毒性（通常以14天LC50表示），评估其对土壤生态系统关键生物的潜在危害，为环境风险评价提供基础数据。
2. 试验原理 蚯蚓（常用赤子爱胜蚓 Eisenia fetida）是土壤生态系统的重要指示生物，对污染物敏感。将其暴露于掺有不同浓度受试物的标准人工土壤中，持续14天，记录死亡率，计算半数致死浓度（LC50），评价受试物的急性毒性。
3. 主要试验材料与设备
- 试验生物： 赤子爱胜蚓 (Eisenia fetida, 成年健康蚯蚓，环带明显，体重300-600毫克）。
- 人工土壤（OECD标准）：
- 70% 石英砂 (50-200 μm粒径)
- 20% 高岭粘土 (Kaolin clay， ≥ 30% 高岭石)
- 10% 泥炭藓 (Sphagnum peat, 研磨过筛<1mm，pH调至5.5-6.0)
- 碳酸钙 (CaCO3, 用于调节最终混合土壤pH至6.0±0.5)
- 受试物： 待测化学品、废弃物浸提液或环境样品（如污染土壤）。
- 稀释水/载体： 去离子水或符合标准的水（如曝气自来水）。难溶物可选用无毒惰性载体（如石英砂）。
- 试验容器： 玻璃或惰性塑料容器（如1升广口瓶），具通气孔盖。
- 恒温培养箱： 温度控制于20±1°C，连续黑暗或16:8小时光暗循环。
- 其他设备： 分析天平、pH计、湿度计、镊子、称量纸、滤纸等。
4. 试验设计
- 浓度设置： 至少设置5个几何级数递增的受试物浓度组和1个空白对照组（仅人工土壤+水）。必要时设载体对照组。最高浓度应能引起显著毒性（如>50%死亡率），最低浓度应无明显毒性（如<10%死亡率）。预期浓度未知时需进行预试验。
- 重复设置： 每个浓度组及对照组设置≥4个平行试验容器。
- 蚯蚓数量： 每个试验容器放置10条健康成年蚯蚓。
- 试验介质：
- 固体化学品/废弃物/土壤： 按比例与人工土壤充分混合均匀。最终土壤含水量为干重的35-40%。
- 液体化学品/浸提液： 直接加入人工土壤并混匀至目标浓度和湿度。
- 暴露条件：
- 温度： 20 ± 1°C
- 湿度： 培养箱空气相对湿度 ≥ 80%
- 光照： 连续黑暗 或 16小时光照:8小时黑暗循环
- 持续时间： 14天 (± 数小时)
5. 试验步骤
- 人工土壤配制： 严格按比例混合各组分，加水至目标湿度（约35-40%干重），充分混匀平衡至少24小时。测试最终pH（应为6.0±0.5）。
- 受试物处理： 将受试物按设计浓度加入人工土壤（或替代部分土壤），加入适量水调节湿度，充分混匀。对照组仅加相应体积的水或载体。
- 装置试验容器： 每容器装入适量处理好的湿润土壤（如750g湿重），保证蚯蚓有足够活动空间。轻压土壤表面。
- 蚯蚓暴露： 将经滤纸清水清洗并用吸水纸吸干体表水分的健康蚯蚓称重（可选）后，小心放入各容器土壤表面，使其自然钻入。记录起始时间。
- 培养与维持： 容器加盖（确保透气），置于设定好条件的恒温培养箱中。
- 观察与记录:
- 观察频率： 第1、2、4、7、10、14天进行系统观察。
- 观察内容：
- 蚯蚓死亡数（无刺激反应即判定死亡）。
- 蚯蚓异常行为（如剧烈扭动、出血、断裂、体色异常）。
- 土壤表面状况（霉变、异常气味）。
- 试验期间维持土壤湿度（必要时添加去离子水）。
- 试验结束： 第14天，取出所有蚯蚓，清洗，鉴定死活。记录最终死亡数。
6. 数据处理与结果评价
- 数据整理： 计算各平行容器及每浓度组的累计死亡率。
- LC50计算： 采用概率单位法、寇氏法、Spearman-Karber法等统计方法，计算14天半数致死浓度（14-d LC50）及其95%置信区间。
- 结果有效性判断（需满足以下条件）：
- 对照组14天死亡率 ≤ 10%。
- 蚯蚓平均重量变化在合理范围内（无显著异常）。
- 土壤理化性质（如pH）无明显异常变化。
- 毒性分级（参考）： 根据LC50值大小，可定性评价受试物的毒性级别（如极高毒、高毒、中毒、低毒、微毒）。
7. 试验报告 报告应清晰、完整地包含以下信息：
- 试验名称、目的、依据标准（如参考OECD 207）。
- 受试物：名称、理化特性、来源、处理储存方法（不得出现企业名称）。
- 供试生物：种类、学名、来源、健康状况、驯养条件。
- 试验条件：人工土壤详细组成及配制方法、试验容器、温度、湿度、光照、暴露周期、浓度设置依据。
- 试验过程：蚯蚓处理、暴露方式、观察方法与频率、维持措施。
- 试验结果：逐日死亡率记录表、各浓度组累计死亡率、LC50值及95%置信区间、统计方法、对照组数据、任何观察到的亚致死效应（行为、形态异常）、土壤pH变化、试验期间遇到的问题。
- 结果讨论与结论： 对受试物急性毒性进行评价，讨论结果的环境意义及可能的局限性。严格避免出现任何企业或商业机构名称。
8. 质量控制与注意事项
- 使用健康、大小均匀的蚯蚓。
- 确保人工土壤组成和配制符合标准，pH值正确。
- 受试物与土壤务必混合均匀。
- 严格控制温度、湿度条件。
- 操作蚯蚓时动作轻柔，避免伤害。
- 接触化学品时佩戴个人防护装备（手套、实验服、必要时防护眼镜）。
- 试验结束，含毒性物质的土壤和蚯蚓尸体按危险废弃物规范处置。
- 保持试验区域清洁卫生。
本指南提供了进行蚯蚓急性毒性试验的标准框架，实施者应根据具体受试物特性和实验室条件进行必要的优化和验证。