鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames 试验）

发布时间：2025-06-23 08:38:41 阅读量：3 作者：生物检测中心
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鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）：诱变剂检测的金标准

引言 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验，即著名的Ames试验，是遗传毒理学领域里程碑式的体外检测方法。由Bruce Ames教授及其团队于20世纪70年代开发，该试验通过利用特异的细菌菌株，高效、快速地评估化学物质诱发基因突变的能力。因其成本低、操作简便、与哺乳动物致癌性高度相关，已成为全球化学品、药品、食品添加剂等安全性评估不可或缺的首筛工具。

一、 核心原理：利用营养缺陷型的回复突变

试验的核心在于使用**组氨酸营养缺陷型（his⁻）**的鼠伤寒沙门氏菌突变株。这些菌株因其组氨酸合成途径中的关键基因（如hisG46、hisD3052等）发生突变，丧失了在缺乏组氨酸的基本培养基上生长的能力。

  • 测试过程：
    1. 将待测物质（受试物）与特定浓度的细菌悬浮液混合。
    2. 添加模拟哺乳动物代谢活化的系统（通常为S9混合液，含啮齿动物肝微粒体酶）。
    3. 将混合物加到仅含微量组氨酸（支持细菌有限分裂几代）的基础培养基（如最低葡萄糖琼脂平板）上。
    4. 孵育（通常37°C，48-72小时）。
  • 结果判读：
    • 如果受试物无诱变性：细菌无法合成组氨酸，耗尽培养基中微量组氨酸后停止生长，平板上仅出现少量或无背景菌苔（由自发回复突变或残留组氨酸支持）。
    • 如果受试物有诱变性：它能诱导细菌发生回复突变，修复组氨酸合成基因的功能，使细菌恢复合成组氨酸的能力。这些回复突变菌可在缺乏组氨酸的培养基上持续分裂，形成肉眼可见的菌落（回复突变子）。
    • 阳性结果：与阴性（溶剂）对照组相比，受试物组在特定菌株上诱导产生的回复突变菌落数呈现剂量依赖性的显著增加（通常要求达到或超过自发回复突变数的2倍）。

二、 试验系统的关键要素

  1. 标准菌株组（常用TA系列）： 试验通常使用一组具有不同遗传特性的菌株组合，以提高检测不同类型基因突变（碱基置换、移码突变）的灵敏度。常用菌株包括：

    • TA98: 检测移码突变（hisD3052突变，含pKM101质粒增强易错修复，含R因子抗氨苄青霉素）。
    • TA100: 检测碱基置换突变（hisG46突变，含pKM101质粒，含R因子）。
    • TA1535: 检测碱基置换突变（hisG46突变，不含pKM101质粒，含R因子）。
    • TA1537: 检测移码突变（hisC3076突变，不含pKM101质粒，含R因子）。
    • TA102: 检测氧化损伤和交联剂引起的突变（hisG428突变，位于多重拷贝的pAQ1质粒上，含pKM101质粒，对四环素敏感而非氨苄青霉素）。 使用组合能覆盖更广的诱变机制。

  2. 代谢活化系统（S9 Mix）：

    • 目的： 模拟哺乳动物体内的肝脏代谢。许多前诱变剂（本身无诱变性）需经代谢酶（主要是细胞色素P450酶系）激活才具有诱变性。
    • 成分： 通常由经酶诱导剂（如Aroclor 1254或苯巴比妥/β-萘黄酮）处理的啮齿动物（大鼠或仓鼠）肝脏制备的肝微粒体组分（S9），加上必要的辅因子（NADPH再生系统、缓冲盐等）。
    • 应用： 试验必须包含加S9（模拟代谢活化） 和 不加S9（检测直接诱变剂） 两部分，以全面评估受试物的遗传毒性潜能。

  3. 试验方法（常用平板掺入法）：

    • 顶层琼脂（含微量组氨酸和生物素）与受试物、细菌悬浮液、S9 Mix（如适用）混合。
    • 立即倾倒于最低葡萄糖琼脂平板上，摇匀。
    • 待顶层凝固后，倒置培养。计数回复突变菌落数。

  4. 阴性对照与阳性对照：

    • 阴性对照： 仅使用溶剂（如DMSO、水），用于确定菌株的自发回复突变背景值。
    • 阳性对照： 使用已知诱变剂（如不加S9时用叠氮钠、甲基磺酸甲酯；加S9时用2-氨基芴、环磷酰胺），用于验证试验系统和S9 Mix的有效性。

三、 结果评价与意义

  1. 剂量-反应关系： 是判断阳性结果的关键依据。受试物应在多个浓度梯度下进行测试，观察回复突变菌落数是否随浓度增加而增加。
  2. 统计学显著性： 阳性结果通常要求至少一个浓度点的回复突变菌落数比阴性对照组有统计学意义上的显著增加（如p<0.05），且增加幅度达到或超过背景值的2倍（倍数增加标准可能略有差异）。
  3. 可重复性： 阳性结果应在独立的重复试验中得到确认。
  4. 生物学意义解释：
    • 阳性结果表明受试物对该测试菌株具有致突变性。这提示该物质有可能损伤DNA，具有潜在的遗传毒性风险。
    • Ames试验阳性是潜在致癌性的重要预警信号。大量研究表明，Ames试验结果与啮齿类动物致癌性试验结果具有高度的相关性（约80-90%的致癌物在此试验中呈阳性）。
    • 阴性结果表明，在当前试验条件下，未检测到受试物对所用菌株的致突变性。

四、 应用与优缺点

  • 广泛应用领域：
    • 新化学品（工业化学品、农药）的安全性评价和法规注册（如REACH, GHS）。
    • 药品研发中的遗传毒性筛选（ICH指导原则）。
    • 食品添加剂、化妆品原料的安全性评估。
    • 环境污染物（水、土壤、空气）的遗传毒性监测。
    • 药物杂质、医疗器械浸提物的遗传毒性风险评估。
    • 混合物（如复杂环境样本）初筛。
  • 主要优点：
    • 快速高效： 数天内出结果，成本相对较低。
    • 灵敏度高： 能检测极低浓度的诱变剂。
    • 高通量： 适合大量样品筛选。
    • 与致癌性高度相关： 是目前预测潜在致癌物最有效的短期试验之一。
    • 机制明确： 直接检测基因点突变。
  • 主要局限性：
    • 原核生物系统： 细菌与哺乳动物的DNA损伤修复、代谢、染色体结构等存在差异。阳性结果提示风险，但不直接等同于哺乳动物体内效应；阴性结果不能完全排除在哺乳动物系统中具有遗传毒性。
    • 代谢差异： S9 Mix虽能模拟肝脏I相代谢，但不能完全代表体内复杂的代谢网络（包括II相代谢、器官特异性代谢）和药代动力学。
    • 检测终点局限： 主要检测点突变（碱基置换、移码），对染色体畸变、非整倍体等大范围损伤不敏感。
    • 菌株限制： 即使使用菌株组合，也无法涵盖所有可能的突变机制和靶点。
    • 假阴性与假阳性： 存在假阴性（如某些需特殊代谢的致癌物）和假阳性（如某些仅对细菌特异的杀菌剂）的可能性。

五、 法规地位与标准化

Ames试验是国际上公认的标准遗传毒性测试组合（通常由Ames试验、体外哺乳细胞染色体畸变试验或微核试验、体内哺乳动物骨髓微核试验组成）的核心成员之一。其试验方案已被多个国际权威机构发布的指南所标准化，例如：

  • 经济合作与发展组织（OECD）： 测试指南No. 471《细菌回复突变试验》。
  • 美国环境保护署（EPA）： OPPTS 870.5100《细菌回复突变试验》。
  • 国际人用药品注册技术协调会（ICH）： S2(R1)《人用药物遗传毒性试验和结果分析指导原则》。
  • 中国国家标准（GB）： GB 15193.4《食品安全国家标准 细菌回复突变试验》。

这些指南详细规定了菌株的选择与确认、试验方法（平板掺入法或预培养法）、代谢活化系统、剂量设置、对照设置、结果判定标准、试验报告要求等，确保了试验的科学性、规范性和结果的可比性。

结论

鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）凭借其坚实的理论基础、卓越的实用性以及与致癌性的显著相关性，在其问世后的数十年间始终是遗传毒理学领域无可替代的基石。尽管存在原核生物系统的固有局限，但作为筛选潜在诱变剂和致癌物的第一道高效防线，它在保障化学品、药品、食品和环境安全方面发挥着不可估量的作用。理解其原理、严谨执行标准化方案、并结合体外和体内试验数据进行综合评估，是科学利用Ames试验进行准确风险评估的关键。它不仅是实验室中的常规工具，更是守护公共健康的重要科学卫士。