体外透皮试验（IVPT）

发布时间：2025-06-23 08:38:41 阅读量：8 作者：生物检测中心

体外透皮试验（IVPT）：评估外用制剂透皮吸收的关键工具

摘要： 体外透皮试验（In Vitro Permeation Testing, IVPT）是一种在受控实验室条件下，模拟药物活性成分或化学物质穿透皮肤屏障过程的标准化实验方法。它是评估外用局部给药制剂（如乳膏、软膏、凝胶、贴剂等）透皮吸收特性不可或缺的核心技术，为药物研发、仿制药等效性评价、处方筛选优化以及皮肤暴露风险评估提供关键数据。

一、 IVPT 的定义与核心目的

IVPT 利用离体皮肤（通常为人源或其他种属的皮肤）或经过认证的人工皮肤模型，置于特定的扩散装置（最常用的是Franz扩散池）中。将受试制剂应用于皮肤表面，在设定的温湿度条件下（通常为32±1°C，模拟皮肤表面温度），通过测量受体介质中药物浓度随时间的变化，定量研究药物穿透皮肤的动力学过程。

核心目的包括：

  1. 量化透皮速率： 测定药物单位时间单位面积透过皮肤的量（通量J），特别是稳态透皮速率。
  2. 确定吸收动力学： 了解药物穿透皮肤的时间过程，计算滞后时间。
  3. 评估处方影响： 比较不同剂型、处方组成、药物浓度等对透皮吸收的影响。
  4. 支持生物等效性评价： 对于局部作用的仿制药，IVPT 是证明其与参比制剂具有相似透皮行为、进而推断局部生物等效性的关键方法（特别是在某些监管框架下，如美国FDA针对特定产品的指导原则）。
  5. 皮肤暴露评估： 评估外用化学品（如化妆品、杀虫剂、工业化学品）通过皮肤吸收的潜在风险。
  6. 筛选新分子实体： 在药物开发早期评估候选化合物的透皮潜力。

二、 IVPT 实验设计的关键要素

  1. 皮肤模型的选择与制备：

    • 人源皮肤： 首选，最具有生理相关性。通常来源于腹部、乳房或大腿的整形手术或尸体解剖（需符合伦理规定）。皮肤需仔细去除皮下脂肪，确保厚度一致（全皮或表皮），并在-20°C或-80°C下冷冻保存（有效期需验证）。使用前解冻并在生理盐水中平衡。
    • 动物皮肤： 常用猪耳皮（结构与人皮相似度较高）、无毛小鼠皮、大鼠皮等。更易获取，但种属差异可能导致结果外推至人存在不确定性。选择需谨慎，并需进行相关性研究。
    • 人造/重建皮肤模型： 一些经过验证的重建人类表皮模型（如EpiDerm™, SkinEthic™ RHE等）可用于特定应用，尤其适用于刺激性或腐蚀性物质的初步筛选或机制研究。但其屏障功能通常与天然人皮有差异，应用范围需明确。
    • 皮肤厚度： 需严格控制并记录，确保组间一致性。

  2. 扩散装置：

    • Franz型扩散池： 最常用。分为直立式和倒立式。主要包括：
      • 供体池（Donor Cell）： 放置受试制剂。
      • 皮肤夹持单元： 固定皮肤样品，使角质层面向供体侧。
      • 受体池（Receptor Cell）： 充满受体介质，持续搅拌确保浓度均匀。
      • 取样口： 用于定时采集受体液样品。
    • 流通式扩散池： 受体介质持续流动，更接近生理状态，但操作较复杂。

  3. 受体介质：

    • 选择原则：确保药物在其中的溶解度足够高（满足漏槽条件：浓度≤饱和溶解度的10%），化学稳定，且生理相容。
    • 常用介质：生理盐水（PBS）、生理盐水-乙醇混合液（用于增加难溶性药物的溶解度）、含表面活性剂的缓冲液等。需考察介质对皮肤屏障完整性的潜在影响。
    • 维持漏槽条件至关重要，确保测得的透皮速率真实反映皮肤屏障特性而非受体介质的饱和限制。

  4. 试验条件控制：

    • 温度： 严格控制在32±1°C（模拟皮肤表面温度）。
    • 湿度： 通常控制供体池环境湿度（如使用饱和盐溶液或湿度控制盖），防止皮肤或制剂干燥。
    • 搅拌速度： 受体池需保持恒定且适当的搅拌速度（通常使用磁力搅拌子），以确保受体液充分混合，避免浓度梯度形成。
    • 运行时间： 根据药物特性和研究目的设定，通常在12-72小时，需能观察到稳态平台的建立。

  5. 取样与分析：

    • 在预设的时间点（如1, 2, 4, 6, 8, 12, 24小时等）定量采集适量受体液样品（同时补充等温等体积的新鲜受体介质）。
    • 使用经过充分验证的、高灵敏度、高选择性的分析方法（如高效液相色谱法HPLC、液相色谱-质谱联用法LC-MS/MS）测定样品中药物的浓度。
    • 必要时，试验结束时需测定皮肤中滞留的药物量（清洗皮肤表面后，匀浆提取分析）。

三、 数据处理与参数计算

基于累积透过量（Q_n）随时间（t）的数据：

  • 累积透过量 (Q_n, µg/cm²): 指在时间点t时，单位面积皮肤累积渗透到受体液中的药物总量。
  • 透皮速率/通量 (J, µg/cm²/h): 单位时间单位面积皮肤透过的药物量。稳态通量由累积透过量-时间曲线在稳态线性段的斜率求得： J = dQ/dt
  • 滞后时间 (Lag Time, t_lag, h): 药物从制剂中释放并穿过皮肤屏障所需的时间。通常通过将稳态线性段外推至时间轴得到。
  • 表观渗透系数 (K_p, cm/h): 描述药物渗透皮肤能力的内在参数。由稳态通量除以供体药物浓度C_app（通常视为饱和浓度或标示浓度）计算： K_p = J / C_app

四、 方法学验证 (Method Validation)

IVPT 方法必须经过严格验证以确保其可靠性、重现性和稳健性。关键验证内容包括：

  1. 专属性 (Specificity)： 证明分析方法能准确区分目标药物与分析系统中的其他成分（受体介质、皮肤提取物、降解产物）。
  2. 准确性 (Accuracy)： 通过加样回收率试验评估（通常要求回收率在85%-115%范围内）。
  3. 精密度 (Precision)： 评估日内精密度（重复性）和日间精密度（中间精密度），RSD通常要求≤15%。
  4. 线性范围 (Linearity)： 在预期浓度范围内，响应值与浓度呈良好线性关系（相关系数R²通常≥0.99）。
  5. 定量限/检测限 (LOQ/LOD)： 满足低浓度样品的定量和检测要求。
  6. 稳定性 (Stability)： 考察药物在受体介质、皮肤基质以及处理过程中的稳定性。
  7. 皮肤屏障完整性验证: 在试验开始前，需使用可靠的方法（如氚水预透试验、电阻抗测定）确认所用皮肤样品的屏障功能完整且一致。不合格的皮肤样品应剔除。
  8. 漏槽条件验证： 确认所选受体介质在整个试验期间对药物具有足够的溶解能力，维持漏槽状态。
  9. 系统适用性： 在每次试验运行中应包括适当的系统适用性对照（如已知渗透特性的标准物质或参比制剂）。

五、 IVPT 的核心应用

  1. 局部作用外用制剂的研发与优化：

    • 筛选不同处方、辅料、剂型对药物透皮行为的影响。
    • 优化药物传递效率。
    • 比较不同批次产品的性能一致性。

  2. 局部作用外用仿制药的生物等效性评价：

    • 在特定监管路径下（如基于产品特定指南），IVPT 是证明局部作用的仿制药与参比制剂在作用部位（通常是皮肤各层）达到相同药物浓度-时间曲线的重要方法。通过比较两者的稳态通量、滞后时间、24小时累积透过量等关键参数来评估等效性。

  3. 透皮贴剂（全身作用）的评估：

    • 评估贴剂的体外释放和透皮特性。
    • 支持处方筛选和质量控制。
    • （注：透皮贴剂的最终生物等效性通常仍需体内药代动力学研究证明）。

  4. 经皮吸收风险评估：

    • 评估化妆品成分、农药、工业化学品、环境污染物等通过皮肤接触造成的潜在全身暴露风险。
    • 用于建立暴露模型和设定安全限值。

六、 IVPT 的局限性

  1. 缺乏生理反馈： IVPT 是静态模型，缺少皮肤的代谢活性、血流清除、免疫反应等体内动态过程，测得的透皮速率可能高于体内实际吸收率（尤其在血流清除快的部位）。
  2. 皮肤来源变异性： 个体差异、解剖部位、年龄、性别、储存条件等均会影响皮肤屏障性质，需通过严格筛选和标准化操作尽量减小。
  3. 模型简化： 难以完全模拟制剂在皮肤表面的铺展、干燥、摩擦、衣物覆盖等实际使用情况。
  4. 皮肤屏障损伤模拟困难： 准确模拟临床疾病状态下（如湿疹、银屑病）或受损皮肤的渗透性具有挑战性。
  5. 高变异性风险： 实验环节多，可能导致结果变异性较大，需通过严格的方法验证和规范化操作来控制。

七、 规范与未来趋势

IVPT 的应用日益广泛，其标准化受到全球监管机构（如FDA, EMA）的高度重视。在不断出台和完善的指导原则（如美国FDA关于特定局部仿制药产品的指南、OECD皮肤吸收试验指南428）推动下，IVPT 的方法学、验证要求和数据分析标准正趋于统一和严格。

未来发展方向包括：

  • 更复杂体外模型开发： 整合多种皮肤细胞类型（角质形成细胞、黑色素细胞、朗格汉斯细胞、成纤维细胞）、重建皮肤附属器（毛囊、汗腺）甚至免疫细胞，以更好地模拟体内环境和评估免疫原性/刺激性。
  • 微流控与器官芯片技术： 构建动态的“皮肤芯片”，整合血流模拟和代谢功能，提高预测体内相关性的能力。
  • 高通量筛选平台： 发展小型化、自动化的扩散装置和分析流程，加速早期候选物筛选和处方优化。
  • 先进成像技术应用： 如共聚焦拉曼光谱、质谱成像等，用于原位、无标记地可视化药物在皮肤不同深度的分布。
  • 大数据与建模： 整合大量IVPT数据，建立更准确的体外-体内相关性模型和渗透性预测模型。

结论：

体外透皮试验（IVPT）作为一项成熟且不断发展的关键技术，在评估外用制剂的透皮吸收行为方面发挥着不可替代的作用。它为药物研发、仿制药评价、处方优化和皮肤暴露风险评估提供了宝贵且相对可控的数据。尽管存在模拟体内复杂生理环境的局限性，但通过持续的方法学优化、严格的验证要求以及与新兴技术（如复杂体外模型、器官芯片）的融合，IVPT 的科学价值和预测能力将持续提升，为保障外用药品的安全、有效和质量可控，以及化学品的安全评估提供更加强有力的科学支撑。其标准化和规范化应用是全球监管科学和制药工业界的共同目标。