流式细胞凋亡试验

发布时间：2025-06-23 08:38:41 阅读量：2 作者：生物检测中心

流式细胞术检测细胞凋亡技术详解

一、 核心检测原理与方法

流式细胞术主要通过检测凋亡过程中细胞发生的系列特征性变化来识别凋亡细胞：

  1. 磷脂酰丝氨酸(PS)外翻检测 (Annexin V 法)

    • 原理: 正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)主要位于细胞膜内膜面。凋亡早期，PS会外翻暴露于细胞膜外表面。Annexin V是一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力。
    • 方法: 使用荧光素标记的Annexin V (如Annexin V-FITC, Annexin V-APC) 与细胞孵育。Annexin V阳性染色细胞指示PS外翻。
    • 区分坏死/晚期凋亡细胞: 通常同时使用核酸染料碘化丙啶(PI)或7-AAD。这些染料不能穿透完整细胞膜，但可进入膜完整性丧失的坏死或晚期凋亡细胞，使其染上红色荧光。因此：
      • Annexin V⁻ / PI⁻ (或 7-AAD⁻): 活细胞 (正常状态)。
      • Annexin V⁺ / PI⁻ (或 7-AAD⁻): 早期凋亡细胞 (PS外翻，膜完整)。
      • Annexin V⁺ / PI⁺ (或 7-AAD⁺): 晚期凋亡或坏死细胞 (PS外翻，膜破裂)。
      • Annexin V⁻ / PI⁺ (或 7-AAD⁺): 通常认为是死细胞或实验操作中受损细胞 (无PS外翻，膜破裂)。需要注意排除。
    • 关键点: 需含钙缓冲液 (如含Ca²⁺的PBS或商品化结合缓冲液) 孵育；避免EDTA等螯合剂。

  2. 细胞膜通透性/完整性检测 (DNA染料排斥法)

    • 原理: 利用PI、7-AAD、DAPI、Hoechst 33342等核酸染料不能穿透活细胞和早期凋亡细胞的完整细胞膜，但能进入膜受损细胞的特性。
    • 方法: 细胞与核酸染料孵育后上机检测。PI或7-AAD阳性细胞指示膜完整性丧失 (晚期凋亡或坏死)。
    • 应用: 常用于Annexin V法的配套染料，单独使用时主要识别死亡细胞而非早期凋亡。Hoechst 33342可进入活细胞，常与其他染料联用观察亚G1峰。

  3. DNA断裂点标记 (TUNEL法 - 流式应用)

    • 原理: 凋亡过程中，内源性核酸酶激活导致DNA链在核小体间断裂，产生大量3'-OH末端缺口。
    • 方法: TdT酶介导，将荧光素标记的dUTP (如FITC-dUTP) 连接到断裂DNA的3'-OH末端。
    • 检测: 荧光信号强度与DNA断裂程度成正比，阳性信号指示凋亡细胞。
    • 特点: 特异性标记凋亡细胞的DNA断裂，不受坏死影响小。但步骤相对复杂，需固定破膜处理细胞。

  4. Caspase活性检测

    • 原理: Caspase蛋白酶家族是凋亡执行的关键分子。活化的Caspase切割特定底物。
    • 方法:
      • 荧光底物法 (FLICA): 细胞与荧光标记的Caspase特异性底物 (如FAM-DEVD-FMK for Caspase-3/7) 共孵育。活化的Caspase与之不可逆结合，阳性细胞代表具活性的Caspase。
      • 抗体法: 使用针对活化形式Caspase (如Cleaved Caspase-3) 的特异性抗体进行胞内染色。
    • 检测: 流式细胞术检测荧光信号。

  5. 线粒体膜电位检测 (ΔΨm)

    • 原理: 早期凋亡常伴随线粒体膜电位 (ΔΨm) 降低。
    • 方法: 使用亲脂性阳离子荧光染料如罗丹明123 (Rh123)、四甲基罗丹明甲酯 (TMRM)、JC-1等。
      • JC-1: 尤为常用。正常线粒体高ΔΨm时，JC-1聚集形成红色荧光聚合物 (J-aggregates)。ΔΨm降低时，JC-1以单体形式存在，发出绿色荧光。因此，红/绿荧光比值下降指示ΔΨm降低。
      • Rh123/TMRM: ΔΨm降低导致染料摄取减少或滞留能力下降，荧光强度减弱。
    • 检测: 流式细胞术分析荧光强度或比例变化。

  6. 细胞周期亚G1峰分析

    • 原理: 凋亡晚期细胞DNA被降解成小片段，在乙醇固定和去污剂破膜处理时被抽提出来，导致细胞内DNA含量低于G1期细胞。
    • 方法: 细胞经固定破膜后，用PI或DAPI等DNA染料染色。
    • 检测: 流式细胞仪分析DNA含量分布。在DNA直方图上，G1期峰左侧出现的峰即为亚G1峰 (sub-G1 peak)，代表凋亡细胞群体。
    • 应用: 主要检测凋亡晚期群体，需排除操作引起的碎片干扰。

二、 流式细胞凋亡检测通用实验流程要点

  1. 样品制备:

    • 细胞类型: 悬浮细胞直接处理；贴壁细胞需温和胰酶消化 (如含EDTA的缓冲液)，避免过度损伤。
    • 细胞密度: 通常调整至1×10⁶/mL浓度。
    • 对照设置: ESSENTIAL!
      • 阴性对照: 未处理健康细胞。
      • 凋亡诱导阳性对照: (如星形孢菌素、十字孢碱处理的细胞)。
      • 坏死诱导对照: (如加热处理细胞)。对于Annexin V/PI法尤为重要。
      • 单染对照: 每种荧光染料单独染色的样本 (用于补偿调节)。
      • 同型对照: 抗体实验中使用的匹配种属、亚型和荧光素标记的非特异性免疫球蛋白。
      • FMO对照: 多色流式中，除目标通道外抗体均加入的样本 (用于精确设门)。
    • 缓冲液: 使用预冷PBS或专用缓冲液进行洗涤和重悬。Annexin V结合需含Ca²⁺缓冲液。

  2. 染色 (以Annexin V/PI法为例):

    • 收集细胞，PBS轻柔洗涤1-2次。
    • 用适量结合缓冲液重悬细胞 (如100 μL)。
    • 加入适量荧光素标记的Annexin V (按试剂说明)，避光室温孵育10-15分钟。
    • 加入适量PI或7-AAD (如5-10 μL)，混匀。
    • 加入适量结合缓冲液 (如400 μL)，立即上机分析。避免长时间放置。

  3. 流式上机分析与补偿调节:

    • 仪器准备: 开机预热，进行性能质控 (如使用标准荧光微球)。
    • 荧光补偿: 使用单染对照样本，调节各荧光通道间的补偿值，消除光谱重叠干扰。这是多色分析准确的关键！
    • 设门策略:
      • 首先在FSC-A/SSC-A散点图中圈出主要细胞群体 (通常排除碎片和小颗粒)。
      • 单细胞门：使用FSC-H/FSC-A或SSC-H/SSC-A去除粘连体。
      • Annexin V/PI: 在Annexin V-FITC (或其他荧光素) vs PI (或7-AAD) 的双参数散点图上定义象限门：
        • 左下象限 (Annexin V⁻/PI⁻): 活细胞
        • 右下象限 (Annexin V⁺/PI⁻): 早期凋亡细胞
        • 右上象限 (Annexin V⁺/PI⁺): 晚期凋亡/坏死细胞
        • 左上象限 (Annexin V⁻/PI⁺): 通常为死细胞/碎片/操作损伤细胞 (需谨慎解读)
    • 数据收集: 每个样本建议收集≥10,000个目标细胞事件。

  4. 数据分析与解读:

    • 计算各象限 (或门内) 细胞占总分析细胞的百分比。
    • 报告早期凋亡率、晚期凋亡/坏死率、总凋亡率 (通常为早+晚期凋亡)。
    • 结合生物学背景和对照组结果进行解读。注意区分凋亡与坏死。
    • 考虑总体细胞数量变化：凋亡可能导致培养中细胞总数减少，仅分析残余细胞比例可能低估实际凋亡程度。

三、 方法选择与注意事项

  • 常用组合: Annexin V/PI (或7-AAD) 法是检测早期凋亡最常用、便捷的双参数方法。
  • 特异性阶段: 检测早期凋亡首选Annexin V法；验证凋亡通路可选Caspase活性检测；检测晚期凋亡可用TUNEL或亚G1峰；线粒体膜电位变化是重要的早期事件。
  • 多参数分析优势: 流式细胞术可同时组合多种探针 (如Annexin V, PI, Caspase活性染料, 表面标志物抗体)，分析特定细胞亚群的凋亡状态。
  • 关键注意事项:
    • 样品新鲜度: 尽快检测 (尤其是Annexin V法)，避免放置过程中状态改变。
    • 温和操作: 整个流程避免剧烈振荡、高速离心，减少机械损伤。
    • 精准孵育: 严格控制染色时间、温度、避光。
    • 缓冲液成分: 特别注意钙离子、EDTA等螯合剂对Annexin V结合的影响。
    • 细胞碎片干扰: 在分析前尽量去除细胞碎片，并在设门时排除。
    • 死细胞干扰: 避免死细胞比例过高影响Annexin V早期凋亡检测的准确性。
    • 仪器状态与补偿: 保证流式细胞仪状态良好，补偿调节精确到位。
    • 合理对照: 严格设置和正确使用对照样本是结果可靠性的前提。
    • 生物学重复: 实验设计需包含足够的生物学重复次数 (n≥3)。

四、 总结

流式细胞术为细胞凋亡研究提供了强大而灵活的工具箱。通过选择不同的荧光探针组合，研究人员可以多维度、定量地揭示凋亡发生的阶段、分子机制及在特定细胞群体中的动力学特征。深入理解每种方法的原理、适用范围和技术要点，并严格规范实验操作与数据分析流程，是获得可靠、可重复的凋亡检测结果的关键。持续的流式技术和新探针的发展，将进一步提高凋亡检测的精确性和信息维度。

参考文献格式 (示例)：

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