流式细胞术鉴定细胞表面抗体测试技术解析
流式细胞术鉴定细胞表面抗体测试是一项基于抗原-抗体特异性结合原理，利用荧光标记技术对细胞表面特定分子进行定性、定量分析及细胞群体分型的强大技术平台。其核心在于解析细胞表面标志物的表达特征。
核心原理：荧光探针与细胞识别
- 抗原-抗体结合： 检测的基础是细胞表面目标分子（抗原）与特异性抗体分子之间的高亲和力、特异性结合。
- 荧光信号标记： 抗体分子预先与特定的荧光染料（如 FITC、PE、APC、PerCP 等）偶联。当荧光标记抗体与细胞表面相应抗原结合后，该细胞即被“标记”上荧光信号。
- 流体聚焦与激光激发： 细胞悬液在鞘液包裹下单行排列高速流过检测区。多束不同波长的激光聚焦照射流过的单个细胞。
- 光信号采集与分析：
- 散射光信号： 激光照射细胞产生散射光。前向散射光（FSC）强度主要反映细胞的大小（体积/横截面积）；侧向散射光（SSC）强度主要反映细胞内部结构的复杂性（如颗粒度、核型）。
- 荧光信号： 结合在细胞上的荧光标记抗体被特定波长的激光激发，发射出波长更长的荧光。仪器配备多个滤光片和光电检测器（如光电倍增管 PMT），分别收集不同荧光染料发射的特定波段的光信号。
- 信号转换与数据处理： 检测器将接收到的光信号（散射光和荧光）转换成电信号，再转换为数字信号。强大的配套软件对每个细胞的多种信号（多个散射光参数 + 多个荧光通道参数）进行实时采集、存储和分析。
标准测试流程
- 样本制备：
- 样本来源： 血液、骨髓、淋巴结、组织解离液、体外培养细胞等。
- 细胞分离与洗涤： 获取单细胞悬液，去除红细胞（如使用裂解液）、碎片和血小板。常用缓冲液（如含蛋白质和 EDTA/钠盐的 PBS）洗涤细胞，去除未结合蛋白和血清干扰。
- 细胞计数与活力评估： 调整细胞浓度至适当范围（例如 10^6 - 10^7 个/mL），确保细胞活力良好（通常>90%）。
- 抗体标记（染色）：
- 直接法（推荐）： 使用预先偶联了荧光染料的特异性抗体直接孵育细胞样本。操作相对简单快捷，避免了非特异性结合。
- 间接法： 先使用未标记的一抗孵育细胞，再使用荧光标记的二抗（抗一抗种属的抗体）进行孵育。可放大信号，但步骤多，背景可能更高。
- 染色条件： 通常在冰上或 4°C 避光进行，孵育时间（如 15-30 分钟）和抗体浓度需优化。加入 Fc 受体阻断剂可减少非特异性结合。
- 洗涤： 孵育后，用缓冲液充分洗涤细胞，去除未结合的游离抗体。
- 固定（可选）： 如需延迟上机检测或进行胞内染色，可使用多聚甲醛等固定剂固定细胞（可能影响部分表位）。
- 流式细胞仪上机检测：
- 仪器校准： 使用标准微球（如校准微球、补偿微球）调整仪器光学系统（激光延迟、激光功率）、电子增益（PMT 电压），并进行荧光补偿校正。
- 阈值设置： 通常设置 FSC 或 SSC 阈值以排除碎片和噪音信号。
- 获取数据： 将处理好的细胞悬液上机，仪器根据预设方案获取数千至数百万个细胞的多个参数数据。
- 数据分析：
- 设门策略：
- 利用 FSC/SSC 散点图初步区分细胞群（如淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、碎片）。
- 在目标细胞群（门内细胞）上进一步分析荧光表达。
- 使用额外的标志物（如死活染料排除死细胞、CD45/SSC 区分白细胞亚群）进行更精确的分层设门。
- 荧光表达分析：
- 单参数直方图： 显示单个荧光通道上细胞数量的分布，区分阴性、弱阳性、阳性细胞群。常用指标包括阳性细胞百分比、平均荧光强度（MFI）、几何平均荧光强度（GeoMFI）、中位荧光强度（MedFI）。
- 双参数散点图/等高线图： 同时显示两个荧光参数的关系，识别共表达或互斥表达的细胞亚群。
- 多参数组合与分析： 现代仪器可同时检测数十个参数，通过复杂组合分析精细划分细胞亚群和功能状态。
- 荧光补偿校正： 由于荧光染料的发射光谱存在重叠，一个通道检测到的信号可能包含临近通道荧光染料的渗漏信号。必须在数据分析前或分析时进行数学补偿校正，确保荧光信号只来源于对应的染料。
- 设门策略：
核心优势
- 高通量： 每秒可检测分析数千至上万个细胞。
- 多参数： 可同时对单个细胞分析多个表面标志物（常规 8-30 色以上）。
- 高灵敏度： 可检测低丰度表达的抗原。
- 定量化： 不仅提供阳性细胞百分比，还能提供荧光强度（如 MFI）信息，反映抗原表达水平。
- 细胞群体分析： 可基于物理特性和标志物表达，精细区分和定量分析复杂样本中的不同细胞亚群。
- 功能分析结合： 可结合表面标志物分析胞内因子、增殖标记、信号转导分子等。
主要应用领域
- 免疫学研究： 免疫细胞分型（T、B、NK、髓系细胞亚群鉴定）、激活状态、分化阶段、细胞因子受体分析等。
- 血液学诊断：
- 白血病/淋巴瘤免疫分型： 通过分析异常细胞群的表面抗原表达模式进行诊断、分型和微小残留病监测。
- 贫血、血小板疾病研究： 分析红细胞、血小板相关抗原。
- 肿瘤学： 肿瘤干细胞标记物检测、免疫微环境分析（如肿瘤浸润淋巴细胞 TILs 表型）。
- 干细胞研究： 造血干细胞、间充质干细胞等干/祖细胞鉴定与分选。
- 移植医学： HLA 分型、交叉配型、移植物抗宿主病监测、嵌合体分析。
- 基础细胞生物学： 细胞周期、凋亡检测（常需结合表面标志物）、黏附分子表达等。
- 药物研发与治疗监测： 药效评估、靶点表达水平检测（如 CD20、CD19）、免疫治疗（如 CAR-T）后免疫重建监控。
质量控制的关键要素
- 样本质量： 确保样本新鲜度、活力及单细胞悬液质量。
- 抗体选择与验证： 使用经过验证的高质量、特异性抗体，注意抗体克隆号、荧光染料、适用种属及推荐用量。
- 实验方案优化： 包括抗体滴定确定最佳浓度、染色时间/温度、洗涤次数等。
- 对照设置：
- 阴性对照： 未染色细胞（基础荧光背景）、荧光标记的同型对照 IgG（评估非特异性 Fc 结合）。
- 阳性对照： 已知表达目标抗原的细胞（确认抗体有效性及实验步骤）。
- 荧光扣除对照： 单染管（每个荧光染料单独染色样本），用于精确计算荧光补偿。
- 死活细胞鉴别： 使用核酸染料（如 PI、7-AAD、DAPI）或胺反应性染料排除死细胞干扰。
- 仪器校准与维护： 定期进行标准化操作，确保仪器性能稳定。
- 数据分析标准化： 使用一致的设门策略和分析方法。
总结
流式细胞术鉴定细胞表面抗体测试是现代生命科学和医学诊断不可或缺的核心技术。其强大的多参数、单细胞、高通量分析能力，为深入理解细胞异质性、精确解析免疫状态、精准诊断疾病以及评估治疗效果提供了强有力的工具。深入理解其原理、熟练掌握标准化操作流程并严格执行质量控制，是获得可靠、可重复结果的根本保障。该技术的持续发展和广泛应用，将持续推动基础研究和临床诊疗的进步。