细胞迁移侵蚀 Transwell 检测 - 中析研究所生物检测中心

细胞迁移与侵蚀能力评估：Transwell 检测详解

细胞迁移（Cell Migration）指细胞在化学或物理信号引导下发生的位置移动，是胚胎发育、免疫应答、组织修复及伤口愈合等生理过程的核心。细胞侵蚀（Cell Invasion） 则特指细胞主动降解并穿越细胞外基质（ECM）或基底膜的迁移行为，是肿瘤转移、炎症细胞浸润等病理过程的关键步骤。准确评估细胞的迁移和侵蚀能力，对于理解发育机制、疾病发生发展及药物筛选至关重要。

Transwell 检测（Transwell Assay） 作为一种经典、直观且操作相对简便的体外实验技术，被广泛应用于细胞迁移和侵蚀能力的定量评估。

一、 Transwell 检测核心原理

Transwell 装置的核心部件是一个带有微孔滤膜（通常为聚碳酸酯材质）的可插入式培养小室（Insert Chamber）。该小室被放置于一个多孔培养板（如24孔板）的孔内，形成上下两个互通的腔室：

上腔室 (Insert)： 通常加入待测细胞悬液（不含或含低浓度血清），细胞位于滤膜的上表面。
下腔室 (Well)： 加入含高浓度趋化因子（如血清、特定生长因子、细胞因子或条件培养基）的完全培养基，形成化学浓度梯度（趋化梯度）。

迁移/侵蚀过程：

趋化作用： 下腔室中的趋化因子向上扩散，穿过微孔滤膜，在上腔室形成由低到高的浓度梯度。
细胞定向移动： 具有迁移能力的细胞感知到趋化梯度，启动定向迁移程序（如伪足形成、细胞骨架重组）。
穿越屏障：
- 迁移检测： 滤膜为裸膜。细胞依靠自身的迁移能力，沿着浓度梯度方向，从膜的上表面通过滤膜微孔迁移至膜的下表面。
- 侵蚀检测： 滤膜上预先铺覆一层人工重构的基底膜基质（如Matrigel模拟ECM）。细胞必须先分泌蛋白酶（如基质金属蛋白酶MMPs）降解基质屏障，才能穿过基质层和微孔到达膜的下表面。这一步额外模拟了细胞穿越体内ECM屏障的能力。
细胞附着： 迁移/侵蚀到下表面的细胞通常具有较强的粘附能力，会牢固地附着在膜的下表面。

检测终点： 经过一定时间（通常几小时至几十小时）的孵育后，将小室取出。移除上腔室中未迁移/侵蚀的细胞，对迁移/侵蚀至膜下表面的细胞进行固定、染色和计数。细胞数量直接反映了其在特定趋化因子刺激下的迁移或侵蚀能力。

二、 Transwell 检测实验流程要点

实验准备：
- 细胞准备： 待测细胞传代培养至对数生长期，用无血清或低血清培养基制备成单细胞悬液，准确计数。保持细胞活力是关键。
- Transwell小室选择： 根据细胞大小选择合适孔径的滤膜（常用8μm用于肿瘤细胞、巨噬细胞等；5μm用于小淋巴细胞；12μm用于大细胞如中性粒细胞）。侵蚀实验需选择基质胶兼容的滤膜。
- 试剂准备： 无血清培养基、含血清趋化培养基、PBS、固定液（如4%多聚甲醛）、染色液（如0.1%结晶紫、Giemsa、DAPI等荧光染料）。
- 侵蚀实验专属步骤： 将人工基底膜基质（如Matrigel）用预冷的无血清培养基稀释至适宜浓度（浓度需优化），均匀铺覆在Transwell滤膜上表面（避免气泡），置于37°C培养箱中使其凝固（通常需要数小时）。
铺板与孵育：
- 在下腔室（培养板孔）中加入适量含有趋化因子的完全培养基（通常500-600μL）。
- 将Transwell小室小心放入对应的孔中，确保下腔室液体接触到滤膜。
- 在上腔室小心加入适量制备好的细胞悬液（通常100-200μL，细胞密度需优化，避免过密导致挤压迁移）。
- 将整个培养板放入37°C、5% CO2的湿润培养箱中孵育特定时间（时间需根据细胞类型和趋化因子强度进行预实验优化）。
- 注意： 操作轻柔，避免上下腔室液体混合。
终止与清洗：
- 小心取出Transwell小室。
- 关键去除步骤： 用湿润的无菌棉签或PBS轻柔地擦拭掉滤膜上表面未迁移/未侵蚀的细胞（侵蚀实验中需特别注意避免触碰或破坏凝胶层）。此步彻底性是保证结果准确的关键。
- 用PBS轻轻漂洗小室底部1-2次，去除漂浮细胞和碎片。
固定与染色：
- 将小室（滤膜朝上）放入盛有适量固定液（如4%多聚甲醛）的干净培养板中，室温固定15-30分钟。
- 弃去固定液，用PBS轻轻漂洗1-2次。
- 将小室浸入染色液（如0.1%结晶紫）中，室温染色10-30分钟（根据染色液浓度和时间优化）。
- 弃去染色液，用PBS或蒸馏水轻柔、彻底地漂洗掉多余染料，直至背景干净。若使用水溶性染料（如结晶紫），可在显微镜下观察漂洗程度。滤膜可取出放在载玻片上晾干或直接观察。
细胞计数与数据分析：
- 显微镜计数法： 在正置光学显微镜下（使用10倍或20倍物镜），随机选择多个视野（至少5个视野，通常更多），人工计数每个视野中附着在膜下表面的染色细胞数。计算平均值±标准差（SD）或标准误（SEM）。这是最经典的方法。
- 图像分析软件法： 使用显微镜配备的数码相机拍摄整个滤膜或代表性区域的清晰照片，利用图像分析软件（如Image J, Image Pro Plus等）进行自动或半自动细胞计数。此法更客观高效，尤其是细胞数量多时。
- 结果表达： 通常报告迁移/侵蚀细胞数（Migrated/Invaded Cells）或相对于对照组（如下腔室不含趋化因子）的迁移/侵蚀百分比（% Migration/% Invasion）。侵蚀能力有时也表示为迁移细胞数比值（Invasion Index = 侵蚀细胞数 / 迁移细胞数）。
- 重复与统计： 每次实验需设置足够的技术重复（至少3个小室/组），并至少进行3次独立的生物学重复实验。使用适当的统计方法（如t检验、方差分析ANOVA）分析组间差异的显著性（p值）。

三、 Transwell 检测的应用场景

肿瘤转移研究： 评估不同肿瘤细胞系的迁移和侵蚀潜能；研究转移相关基因（如MMPs、整合素、Rho GTPases）过表达/敲低、特定信号通路激活/抑制（如EGF/MAPK, TGF-β/Smad, Wnt/β-catenin）对细胞侵袭能力的影响；筛选具有抗转移潜力的化合物或天然产物。
炎症与免疫学研究： 检测白细胞（如中性粒细胞、单核/巨噬细胞、淋巴细胞）在趋化因子（如IL-8/CXCL8, MCP-1/CCL2, SDF-1/CXCL12）诱导下的趋化迁移能力；评估药物或抗体对炎症细胞浸润的抑制效果。
血管生成研究： 评估内皮细胞在血管生成因子（如VEGF, bFGF）刺激下的管腔形成前迁移能力（常使用Matrigel侵蚀模型）。
伤口愈合研究： 模拟成纤维细胞、角质形成细胞等在生长因子（如PDGF, EGF）诱导下向“伤口”（下腔室）迁移修复的过程。
干细胞研究： 探究干细胞（如间充质干细胞）在特定因子作用下向损伤或炎症部位的归巢迁移能力。

四、实验成功关键与注意事项

细胞状态： 确保细胞处于健康、活力旺盛的对数生长期，传代次数不宜过多。消化细胞应温和（避免过度使用胰酶），制备单细胞悬液且无细胞团块。
趋化梯度稳定性： 避免在孵育过程中晃动培养板，防止破坏梯度。确保小室放置平稳，上下腔室液体无泄漏或混合。趋化因子浓度和孵育时间是关键参数，需预实验优化。
细胞密度优化： 密度过高会导致细胞因接触抑制或资源竞争影响迁移，密度过低则可能计数误差大。需找到能产生可计数、可区分差异的最佳密度。
去除未迁移细胞： 擦拭上表面细胞必须轻柔且彻底，这是避免假阳性结果的核心步骤。棉签蘸湿（常用PBS），避免过度用力刮擦损伤滤膜或已迁移细胞。
基质胶处理（侵蚀实验）： Matrigel需在冰上操作，铺胶均匀无气泡，厚度适中（过厚细胞难以穿透，过薄屏障作用弱）。胶的凝固时间必须充足。胶的浓度和铺胶体积需严格优化。
对照设置： 必须设立有效的对照！
- 迁移检测： 阴性对照（下腔室仅为无血清培养基）、阳性对照（下腔室为含高水平趋化因子的血清培养基，如10% FBS）、空白对照（无细胞）。
- 侵蚀检测： 除了上述对照，通常还需设置单纯迁移对照（同批细胞在未铺胶的Transwell小室中迁移），以计算真实的侵蚀能力（侵蚀指数）。
膜选择与孔径： 根据细胞大小严格选择孔径（5μm, 8μm, 12μm）。孔径过小限制细胞迁移，孔径过大可能导致非趋化性迁移增多。确保选择的膜适用于迁移或侵蚀。
孵育时间： 时间过短细胞迁移数量少误差大，时间过长细胞可能增殖影响结果准确性或已迁移细胞脱落。需通过时间梯度预实验确定最佳孵育窗口。
重复性与统计分析： 严格遵守生物学重复和技术重复原则。使用合适的统计方法处理数据，报告误差范围和显著性水平。避免仅凭单次实验或少量视野计数下结论。
临界点处理： 在迁移细胞较多、计数困难时，可考虑缩短孵育时间或降低细胞密度。侵蚀实验中，若细胞降解能力过强导致基质胶过早被破坏，则需降低细胞密度或缩短时间。

五、 Transwell 检测的优势与局限性

六、总结

Transwell 检测作为一种成熟可靠的工具，在细胞迁移和侵蚀能力的研究中发挥着不可替代的作用。其原理清晰——利用微孔滤膜和化学趋化梯度迫使细胞定向移动并穿越物理屏障；操作流程相对规范——从细胞准备、铺板孵育到固定染色计数；应用范围广泛——涵盖肿瘤转移、炎症反应、血管生成等多个重要领域。

掌握实验成功的关键要素（如细胞状态优化、趋化梯度维持、彻底去除未迁移细胞、严谨的对照设置、基质胶标准化处理及合理的统计分析），并充分认识其优势（直观、简便、可定量）与局限性（静态终点、二维环境、梯度衰减），对于研究者设计严谨实验、获取可靠数据至关重要。随着三维培养、器官芯片、活细胞成像等技术的发展，Transwell 检测可与这些方法结合互补，为深入理解细胞迁移和侵蚀的复杂生物学过程提供更全面的视角。