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细胞增殖检测：MTT法原理与操作指南
一、引言
MTT法是一种广泛应用于体外细胞增殖、毒性及活性检测的经典技术。该方法基于活细胞线粒体脱氢酶对四唑盐的还原作用，生成不溶于水的蓝色甲臜结晶，通过溶解后测定吸光度值，间接反映细胞数量和代谢状态。因其操作简便、成本低、灵敏度高，适用于大规模药物筛选和基础研究。
二、实验原理
- MTT化学特性 MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）为黄色水溶性化合物，可穿透细胞膜进入活细胞。
- 还原反应机制 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶将MTT还原为紫色甲臜结晶（Formazan），该反应依赖NAD(P)H。死细胞或无代谢活性细胞无此能力。
- 定量分析 甲臜结晶经有机溶剂溶解后，在490-570 nm波长处产生特征吸收峰，吸光度值与活细胞数量呈正相关。
三、实验材料与仪器
（通用名称描述，避免品牌信息）
- 细胞类型：贴壁或悬浮细胞系
- 试剂：
- MTT粉末（分子式：C₁₈H₁₆BrN₅S）
- 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）
- 二甲基亚砜（DMSO）或等效有机溶剂
- 细胞培养液（如RPMI-1640、DMEM等）
- 耗材：
- 96孔细胞培养板（平底透明）
- 细胞计数器
- 移液器及无菌吸头
- 微孔板振荡器
- 仪器：
- 酶标仪（可测490-570 nm波长）
- CO₂细胞培养箱
- 生物安全柜
四、实验步骤
1. 细胞铺板与处理
1.1 制备单细胞悬液，调整密度至目标范围（通常1×10⁴~5×10⁴ cells/孔）。 1.2 接种至96孔板，每孔100 μL，边缘孔用无菌PBS填充以减少蒸发误差。 1.3 培养箱（37℃, 5% CO₂）预培养24小时使细胞贴壁。 1.4 加入待测药物/化合物，设置空白孔（无细胞）、对照孔（细胞+无药培养液）及实验组（不同浓度药物），每组≥3复孔。 1.5 继续培养指定时间（24-72小时）。
2. MTT染色
2.1 配制MTT溶液：用PBS溶解MTT粉末至终浓度5 mg/mL，0.22 μm滤膜除菌。 2.2 每孔加入20 μL MTT溶液（终浓度1 mg/mL）。 2.3 培养箱避光孵育4小时，避免振动。
3. 溶解与检测
3.1 小心吸弃上清液（悬浮细胞需离心后操作）。 3.2 每孔加入150 μL DMSO，振荡10分钟使甲臜完全溶解。 3.3 酶标仪测定490 nm吸光度（OD₄₉₀），参比波长630 nm可降低背景干扰。
五、数据处理
- 计算公式： 细胞存活率(%)=OD实验组−OD空白OD对照组−OD空白×100细胞存活率(%)=OD对照组−OD空白OD实验组−OD空白×100
- 结果呈现：
- 绘制药物浓度-细胞存活率曲线
- 计算IC₅₀（抑制50%细胞增殖的浓度）
六、注意事项
- MTT毒性：孵育时间＞4小时可能导致细胞毒性，需预实验优化。
- 结晶溶解：DMSO加入后若残留结晶，可静置延长或轻微加热（≤37℃）。
- 操作避光：MTT及甲臜对光敏感，全程避光操作。
- 误差控制：
- 避免孔间气泡干扰读数
- 细胞密度均匀，避免边缘效应
- 同步化处理降低细胞周期影响
七、方法局限性
- 间接反映增殖：实际检测细胞代谢活性，非直接计数。
- 干扰因素：
- 某些药物可能直接还原MTT（需设药物背景对照）
- 高血清浓度或还原性物质（如维生素C）可能增加假阳性
- 不适用场景：原代细胞或代谢缓慢细胞敏感性较低。
八、参考文献（示例）
- Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods, 65(1-2), 55–63.
- van Meerloo, J. et al. (2011). Cell sensitivity assays: The MTT assay. Methods Mol. Biol., 731, 237–245.
此版本严格遵循学术中立原则，所有实验步骤与试剂均使用通用科学术语描述，确保内容的普适性与可重复性。如需特定细胞类型的优化方案或问题排查，可进一步扩展说明。