无菌检查、支原体检查、细菌内毒素的检测

药品安全三大卫士：无菌检查、支原体检查与细菌内毒素检测

在药品生产的质量控制体系中，无菌检查、支原体检查和细菌内毒素检测构成了保障药品生物安全性的核心“铁三角”。这些检测项目是药品（尤其是注射剂、生物制品、眼用制剂等无菌产品）放行前必经的严格关卡，直接关乎患者的用药安全。

一、无菌检查：杜绝活微生物污染

核心目标： 确证供试品中是否含有任何存活的微生物（包括细菌、真菌）。
监管依据： 各国药典（如中国药典、USP、EP、JP）均强制要求无菌药品必须通过无菌检查。
核心方法：
1. 膜过滤法： 最常用方法。将供试品溶液通过孔径≤0.45μm的无菌滤膜，理论上将所有微生物截留在膜上。然后将滤膜转移至适当的液体培养基中培养。
2. 直接接种法： 将规定量的供试品直接接种到两份适合的液体培养基（如硫乙醇酸盐流体培养基用于需氧及厌氧菌检查，胰酪大豆胨液体培养基用于真菌检查）中。
关键要素：
- 培养基促生长能力： 培养基必须能支持多种微生物生长（验证试验）。
- 培养条件与时程： 通常需氧/厌氧培养基在30-35°C培养至少14天，真菌培养基在20-25°C培养至少14天。
- 阴性/阳性对照： 必须设立阴性对照（确保无菌操作）和阳性对照（用少量标准菌株验证培养基促生长能力）。
结果判定： 所有测试管（过滤法则包括所有培养基管）在培养期间澄清无菌生长，判为符合规定；若任何一管出现浑浊，需进行微生物鉴定和调查，最终判定不合格。
挑战与局限性： 本质是抽样检查，存在统计学风险（假阴性）。强抑菌性的样品需充分中和。无法检出受损或休眠状态的微生物。

二、支原体检查：防范“隐形”病原体

核心目标： 检测是否存在支原体污染。支原体是一类无细胞壁、形态微小多变、能通过常规除菌滤膜的微生物，细胞培养中极易污染，可干扰实验结果，某些种类（如肺炎支原体）可致病。
监管依据： 主要针对生物制品（疫苗、血液制品、重组蛋白、单抗等）、细胞治疗产品、病毒载体制品及利用细胞培养生产的制品。药典或相应指导原则有明确规定。
核心方法（通常采用互补方法）：
1. 培养法（金标准）：
  - 液体培养基增殖： 接种样品于支原体专用液体培养基（含丰富营养、血清、酵母提取物和指示剂）。
  - 固体培养基证实： 培养后期转种至琼脂平板，观察特征性“煎蛋样”菌落。
  - 培养周期长（通常至少28天）。
2. 指示细胞培养法结合DNA荧光染色：
  - 将样品接种于指示细胞（如Vero细胞）。
  - 培养规定天数（通常3-5天）。
  - 用特异性荧光染料（如Hoechst 33258或DAPI）染色细胞核和附着于细胞表面的支原体DNA。
  - 荧光显微镜下观察：正常细胞核呈现规则明亮荧光；支原体污染则可见大量细小、形态不一的荧光颗粒（支原体DNA）附着或散布于细胞表面及周边。
3. 核酸扩增检测法（如PCR）： 特异性扩增支原体保守核酸序列（如16S rRNA基因）。快速灵敏，但需严格验证（特异性、灵敏度、抗干扰能力）并明确检测范围（能检出的支原体菌种）。
关键要素：
- 方法选择与验证： 根据样品特性和法规要求选择合适方法组合并进行验证。
- 阳性与阴性控制： 每次试验必须包含明确的阳性对照（特定支原体菌株）和阴性对照（无核酸酶水等）。
- 样品处理： 可能需稀释、过滤或酶处理以消除干扰。
结果判定： 培养法需无菌落生长；指示细胞法应无典型支原体荧光形态；NAT法应为阴性。任一方法阳性均需调查并导致产品不合格。

三、细菌内毒素检测：量化“热原”风险

核心目标： 定量或限度检测样品中细菌内毒素的含量。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分（脂多糖LPS），进入人体血液或脑脊液可引发强烈的致热反应（发热）、休克甚至死亡。
监管依据： 注射剂、植入性医疗器械、注射用水、透析液等必须进行该项检测并符合药典规定的限值。
核心方法（基于鲎试剂）：
1. 凝胶法（定性/半定量）：
  - 将鲎试剂（鲎血细胞裂解物）与供试品溶液混合。
  - 在适宜温度（通常37±1°C）孵育规定时间（通常60±2分钟）。
  - 观察凝固反应：形成坚实凝胶（倒转180度不流动）为阳性，未凝固或凝胶不坚实为阴性。
  - 通过与系列内毒素标准品平行试验确定供试品的内毒素限值（EU/mL或EU/mg）是否合格。
2. 光度测定法（定量）：
  - 浊度法： 检测反应混合物因凝固形成的浊度变化。
  - 显色基质法： 检测凝固过程中释放出的显色基团（如pNA）在特定波长下的吸光度变化。
  - 通过标准曲线精确计算样品中的内毒素含量。
关键要素：
- 鲎试剂灵敏度（λ）： 每次试验使用已验证灵敏度的鲎试剂。
- 最大有效稀释倍数（MVD）计算： 样品可稀释的最大倍数，以避免干扰且最终浓度仍低于限值。
- 干扰试验： 证明在测试浓度下，样品本身不抑制也不增强内毒素与鲎试剂的反应（需加标回收率在50%-200%）。
- 标准品与对照： 使用标准内毒素（RSE/CSE）、阴性对照（BET水）、阳性对照（λ浓度标准品）。
结果判定： 凝胶法看是否形成阳性凝胶；光度法计算浓度值。结果必须小于该品种规定的内毒素限值（L = K/M，K为阈值剂量（通常5.0 EU/kg/hr），M为最大人用剂量（kg/hr））。