亚慢性毒性试验

亚慢性毒性试验：评估重复暴露毒性的关键桥梁

摘要： 亚慢性毒性试验是药物、化学品、农药、食品添加剂等安全性评价体系中不可或缺的核心环节。它通过模拟目标物在中等时间范围内（通常为14天至90天）重复暴露于实验动物所产生的毒性效应，为评估其潜在健康风险、确定无可见有害作用水平（NOAEL）以及预测长期暴露风险提供关键科学依据。本文将系统阐述亚慢性毒性试验的定义、目的、实验设计、观察指标、结果评价及其在毒理学研究中的重要意义。

一、 定义与目的

• 定义： 亚慢性毒性试验（Subchronic Toxicity Study）是指让实验动物（通常为啮齿类和非啮齿类）在一定时期内（通常为实验动物寿命的10%左右），通过相关暴露途径（如经口、经皮、吸入、注射等），每日或定期重复接触受试物，以观察其毒性反应、靶器官、剂量-反应关系以及可逆性的系统性研究。
• 核心目的：
  1. 识别毒性效应： 发现受试物在重复暴露条件下产生的各种毒性作用，包括临床症状、体重变化、食物消耗量改变、血液学、临床生化、尿液分析异常以及组织病理学损伤等。
  2. 确定靶器官： 明确受试物主要损伤或累积的器官系统。
  3. 建立剂量-反应关系： 探索不同剂量水平下毒性效应的发生频率和严重程度，这是风险评估的基础。
  4. 确定无可见有害作用水平（NOAEL）： 找到在该试验条件下，未观察到任何与受试物相关的有害效应的最高剂量水平。NOAEL是推导安全限值（如每日允许摄入量ADI、参考剂量RfD）的关键起点。
  5. 为慢性毒性试验和致癌试验提供设计依据： 为更长期的试验选择合适的剂量、观察指标和动物模型提供重要参考。
  6. 初步评估毒性效应的可逆性： 通过设置恢复期（停止给药后继续观察一段时间），初步了解毒性损害是否可逆。

二、 实验设计要点

一个严谨的亚慢性毒性试验设计需考虑以下关键因素：

1. 受试物： 明确受试物的理化性质、纯度、稳定性及配制方法。
2. 实验动物：
   • 物种： 通常选用两种哺乳动物，一种啮齿类（常用大鼠或小鼠），一种非啮齿类（常用犬或小型猪）。选择依据包括代谢途径、敏感性、实用性以及与人类的相关性。
   • 品系： 使用标准化的、背景资料清晰的近交系或封闭群动物。
   • 性别与数量： 通常雌雄各半。每组动物数量需满足统计学要求，啮齿类通常每组每性别≥10只（主试验组），非啮齿类≥4只。需设卫星组（通常啮齿类）用于恢复期观察。
   • 年龄与体重： 使用健康、初成年动物，起始体重接近。
   • 饲养环境： SPF（无特定病原体）或常规级动物房，严格控制环境条件（温度、湿度、光照周期、通风），自由饮水，给予标准合格饲料。
3. 给药/暴露：
   • 途径： 应尽可能模拟人体预期的实际暴露途径（如口服、皮肤涂抹、吸入、静脉注射等）。
   • 剂量水平： 通常设至少三个剂量组和一个溶剂/赋形剂对照组（阴性对照），有时增设阳性对照组。
     • 高剂量： 应能产生明显的毒性效应（如体重增长抑制、特定器官毒性），但不应导致动物过早死亡或严重痛苦。
     • 中剂量： 应能产生轻微的、可观察到的毒性效应。
     • 低剂量： 应接近或略高于预期的无效应水平，目标是建立NOAEL。
     • 剂量选择依据： 常基于急性毒性试验结果（如LD50）、药效学数据、预期人暴露水平以及前期短期重复给药试验结果。
   • 频率与周期： 通常每日给药/暴露一次，连续进行。最常见周期为90天（大鼠、小鼠）或28天（有时用于初步筛选或特定要求）。 非啮齿类试验周期通常也为90天。
4. 对照组：
   • 阴性对照组（溶剂/赋形剂对照）： 给予不含受试物的溶剂或赋形剂，操作同给药组。用于鉴别受试物本身引起的效应与非受试物因素（如操作应激、溶剂影响）引起的效应。
   • 阳性对照组（可选）： 给予已知毒性物质，用于验证试验系统的敏感性。
5. 恢复期： 在给药期结束后，选取部分动物（卫星组）停止给药，继续饲养观察一段时间（通常为给药周期的1/4或更长，如28天），以评估毒性效应的可逆性或迟发毒性。

三、 主要观察指标

试验期间需进行全面、系统的观察和检测：

1. 一般临床观察：
   • 每日至少一次： 观察动物外观、行为、活动、分泌物、排泄物、呼吸状态等，记录任何异常表现（如嗜睡、震颤、呼吸困难、皮肤损伤等）。
   • 每周至少一次： 精确测量体重和食物/饮水消耗量。体重变化是反映整体毒性的敏感指标。
2. 血液学检查： 通常在试验中期、末期及恢复期结束时采集血液样本检测。
   • 指标： 红细胞计数（RBC）、血红蛋白（Hb）、红细胞压积（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、白细胞计数（WBC）及分类计数、血小板计数（PLT）、凝血时间（如PT, APTT）等。
3. 临床生化检查： 与血液学同期检测，评估器官功能（尤其肝、肾、糖脂代谢）。
   • 肝功能： 丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLOB）、白球比（A/G）等。
   • 肾功能： 尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）、尿酸（UA）、血糖（GLU）、总胆固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、电解质（如Na+, K+, Cl-, Ca2+）等。
4. 尿液分析： 通常在试验末期和恢复期进行。
   • 指标： 外观、体积、pH值、比重、蛋白、糖、酮体、潜血、胆红素、尿胆原、沉渣镜检（细胞、管型、结晶）等。
5. 大体解剖与器官称重： 试验末期（及恢复期）对全部主试验组动物实施安乐死并进行系统解剖。
   • 大体观察： 记录所有器官/组织的外观异常（如颜色、质地、大小、肿块、粘连、出血等）。
   • 器官称重： 称量关键器官的绝对重量并计算相对重量（器官重/体重或脑重），如脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肾上腺、胸腺、睾丸、卵巢、子宫等。器官重量变化是重要的毒性指标。
6. 组织病理学检查： 毒理学评价的“金标准”。
   • 范围： 所有肉眼观察有病变的组织器官，以及所有高剂量组和对照组动物的全部主要器官和组织（通常包括：脑、脊髓、垂体、甲状腺/甲状旁腺、胸腺、心、肺、肝、脾、肾、肾上腺、胰腺、胃、小肠、大肠、肠系膜淋巴结、膀胱、睾丸、附睾、前列腺、卵巢、子宫、骨髓、坐骨神经、皮肤、眼等）。
   • 方法： 组织固定（常用10%中性福尔马林）、石蜡包埋、切片、染色（常规HE染色，特殊染色根据需要）、显微镜下系统观察和详细描述病变性质、程度和分布。通常先检查高剂量组和对照组，若发现病变，再检查中、低剂量组。
7. 其他特殊检查（根据需要）： 如眼科检查、心电图、神经行为学测试、免疫学指标、遗传毒性终点等。

四、 结果评价与报告

• 数据处理： 对计量资料（体重、食耗、血液生化、器官重量等）进行统计学分析（如t检验、方差分析），比较各给药组与阴性对照组的差异显著性。计数资料（发生率）常用卡方检验等。
• 综合分析： 将所有观察指标的结果（临床、血液、生化、尿液、解剖、病理）进行关联性综合分析，判断：
  • 毒性效应是否与受试物相关。
  • 毒性的性质（功能性、器质性、可逆性）。
  • 主要靶器官或靶系统。
  • 剂量-反应关系。
  • 确定NOAEL和LOAEL（最低可见有害作用水平）： 这是试验的核心产出。NOAEL是风险评估的基石。
• 风险评估意义： 结合预期的或实际的人体暴露水平，利用NOAEL（或基准剂量BMD）和安全系数（通常为100，涵盖种间和种内差异），推导出安全限值（如ADI、RfD），用于判断受试物在特定使用条件下的安全性。
• 试验报告： 最终形成详尽的、符合国际规范（如OECD、ICH指导原则）的正式报告，包括所有原始数据、统计结果、代表性病理图片及最终结论。

五、 在毒理学研究体系中的意义与局限性

• 重要意义：
  • 承上启下： 是连接急性毒性和慢性毒性/致癌性研究的桥梁，为后者提供关键设计参数（尤其是剂量选择）。
  • 核心风险评估依据： 为识别危害、建立剂量-反应关系和确定NOAEL提供主要实验数据，是化学品、药品、食品添加剂等健康风险评估的基础。
  • 经济高效： 相较于慢性试验（通常2年），90天亚慢性试验周期较短、成本较低，能有效筛选出需要进一步长期研究的物质。
• 局限性：
  • 无法预测所有长期效应： 90天的暴露不能完全模拟人类可能面临的数年甚至数十年的慢性暴露情况。一些潜伏期长或进展缓慢的效应（如某些癌症、神经退行性疾病）可能在亚慢性试验中不出现或不明显。
  • 外推到人的不确定性： 动物实验结果外推到人类始终存在种属差异（代谢、修复能力等）的不确定性。
  • 高剂量外推风险： 为了观察到效应，试验中常使用远高于人类实际暴露水平的高剂量，从高剂量向低剂量外推存在模型选择的风险。

结论：

亚慢性毒性试验是毒理学安全性评价体系中的支柱性研究之一。通过严谨的实验设计、全面的观察指标和科学的分析评价，它能有效揭示受试物在中等时间重复暴露下的毒性特征、靶器官、剂量-反应关系，并确定关键的NOAEL值。这些结果为初步的人类健康风险评估、指导后续长期研究的设计以及相关产品的安全使用提供了至关重要的科学依据。尽管存在外推和预测长期风险的局限性，亚慢性毒性试验在识别潜在危害和保障公共健康方面扮演着不可替代的角色。随着生命科学技术的发展（如组学技术、体外替代方法），亚慢性试验的设计和评价也在不断优化，以期更精准地预测人类健康风险。

参考文献 (格式示例)：

• OECD. (2018). Test No. 408: Repeated Dose 90-Day Oral Toxicity Study in Rodents. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4.
• OECD. (2018). Test No. 409: Repeated Dose 90-Day Oral Toxicity Study in Non-Rodents. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4.
• ICH. (2009). S4A: Duration of Chronic Toxicity Testing in Animals (Rodent and Non-Rodent Toxicity Testing). International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use.
• Hayes, A. W., & Kruger, C. L. (Eds.). (2014). Hayes' Principles and Methods of Toxicology (6th ed.). CRC Press. (Chapter on Subchronic and Chronic Toxicology)
• 国家药品监督管理局药品审评中心 (CDE)。 (相关技术指导原则，如《药物重复给药毒性试验技术指导原则》)。