28 天经口毒性试验

28天经口毒性试验：评估重复暴露下的健康风险

1. 目的与意义

28天经口毒性试验是药物安全性评价和化学品风险评估的核心短期试验之一。其主要目的在于：

• 识别潜在危害： 确定受试物在28天重复经口给药后对实验动物（通常为大鼠）产生的毒性效应。
• 明确靶器官： 识别受试物主要损害哪些器官或系统。
• 评估剂量-反应关系： 建立毒性效应与给药剂量之间的关联，寻找观察到有害作用的最低剂量水平（LOAEL）和未观察到有害作用的剂量水平（NOAEL）。
• 预测长期风险： 为设计更长期的慢性毒性研究（如90天或2年）提供关键剂量设定依据和初步毒性信息。
• 支持安全阈值设定： 为风险评估中推导参考剂量（RfD）或每日允许摄入量（ADI）等安全阈值提供基础数据。
• 满足法规要求： 该试验是许多国家和地区（遵循经济合作与发展组织OECD测试指南407）对农药、工业化学品、药品、食品添加剂等进行注册或上市的常见法规要求。

2. 实验设计概述

• 受试动物：

  • 物种： 首选健康、年轻的成年大鼠（通常为6-8周龄）。其他啮齿类动物（如小鼠）也可能使用，但大鼠是标准选择。非啮齿类动物（如狗、猴）通常用于更长期或特定目的研究。
  • 性别： 通常包括雄性和雌性动物，以评估可能的性别差异。
  • 数量： 每个剂量组和对照组至少包含5只/性别（常为10只/性别以满足统计学要求）。
  • 饲养： 动物在标准化环境（温度、湿度、光照周期可控）下单笼或群养（需证明无相互影响），自由饮水，喂食标准实验室饲料。

• 试验分组：

  • 对照组： 一个阴性（溶媒/赋形剂）对照组，给予与受试物等体积的载体（如水、玉米油、羧甲基纤维素钠溶液等）。
  • 剂量组： 通常设置至少三个剂量组和一个对照组。剂量水平的选择至关重要：
    • 高剂量： 应能产生明显的毒性效应（如体重抑制、特定器官毒性），但不至于导致过早死亡（死亡率≤10%）或过度痛苦。
    • 中剂量： 预期产生轻微的、可观察到的毒性效应，有助于建立剂量-反应关系。
    • 低剂量： 预期接近或低于预期的人体暴露水平，目标是建立NOAEL。

• 给药途径与频率：

  • 途径： 经口（Oral）。常用方法包括：
    • 灌胃（Gavage）： 使用套管直接将受试物溶液/悬浮液注入胃内。这是最精确控制剂量的方法。
    • 掺入饲料/饮水（Diet/Water Admixture）： 将受试物均匀混合在饲料或饮水中。更符合自然暴露，但剂量精确性略低（取决于动物摄食/饮水量）。
  • 频率： 每天给药一次，连续28天（约相当于啮齿类动物寿命的10%）。

• 观察与检测指标： 贯穿整个试验期进行多层次的观察和检测：

  • 每日观察：
    • 至少两次（如早晚）观察动物的一般状况和行为（活动水平、姿势、被毛、眼睛、粘膜、呼吸、排泄物性状、任何异常行为或临床症状）。
    • 记录发病率和死亡率。
  • 体重与摄食/摄水量：
    • 每周至少称重动物体重两次。
    • 每周至少测量一次饲料消耗量和（若适用）饮水消耗量，计算每周平均值。
  • 功能观察组合（Functional Observational Battery, FOB）：
    • 通常在给药前、给药期间（如第14天）和给药结束时进行。
    • 评估感觉、运动和自主神经系统功能（如对光和声音的反应、抓力、步态、姿势反射、瞳孔反应、体温等）。
  • 眼科检查：
    • 给药前和试验结束时（或在出现眼部症状时）进行眼科检查。
  • 血液学检查（试验结束时）：
    • 采集血液样品（常为抗凝血），分析指标如：
      • 红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）、红细胞压积（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、网织红细胞计数。
      • 白细胞总数（WBC）及分类计数（中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞）。
      • 血小板计数（PLT）、凝血功能指标（如凝血酶原时间PT、活化部分凝血活酶时间APTT）。
  • 临床生化检查（试验结束时）：
    • 采集血清/血浆样品，分析指标反映器官功能：
      • 肝脏： 丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、谷氨酰转肽酶（GGT）、总胆红素（TBIL）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLOB）、白蛋白/球蛋白比（A/G）。
      • 肾脏： 尿素氮/血尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）、血糖（GLU）、电解质（钠Na+、钾K+、氯Cl-、钙Ca2+、磷P）。
      • 肌肉/其他： 肌酸激酶（CK）、总胆固醇（TCHO）、甘油三酯（TG）。
  • 尿液分析（试验结束时或期间）：
    • 收集尿液（常为24小时尿），分析外观、体积、pH、比重、尿蛋白、尿糖、潜血、酮体、胆红素、尿胆原、沉渣镜检（细胞、管型、结晶）等。
  • 大体解剖（试验结束时）：
    • 所有动物（包括试验期间死亡或濒死处死的动物）在麻醉或人道安乐死后进行系统的大体解剖检查。
    • 仔细检查所有体腔、器官和组织，记录肉眼可见的病变（位置、大小、数量、性质）。
  • 器官称重（试验结束时）：
    • 迅速分离并称量关键器官（绝对重量），计算相对于脑重量或终末体重的相对器官重量。常包括：
      • 脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏（通常双肾一起称重）、肾上腺（通常双腺一起称重）、胸腺、睾丸、附睾、卵巢、子宫。
  • 组织病理学检查：
    • 这是毒性评估的基石。通常要求：
      • 所有对照组和高剂量组动物的所有保存器官和组织（通常涵盖40多种，如前述器官、胃肠道、肺、淋巴结、胰腺、皮肤、乳腺、坐骨神经、脊髓、垂体、甲状腺等）均应进行镜检。
      • 中、低剂量组动物：如果在高剂量组或大体解剖中观察到病变的组织器官，以及所有剂量组的靶器官（根据前期信息或本研究观察确定）都应进行镜检。
      • 所有肉眼可见病变的组织都必须进行镜检。
    • 病理学家在不知晓分组信息（盲法）的情况下进行组织切片制备（固定、包埋、切片、染色，通常为苏木精-伊红H&E染色）和显微镜检查。
    • 详细描述任何异常发现（病变的性质、分布、严重程度分级）。

3. 数据收集、分析与报告

• 数据记录： 所有原始数据（观察记录、测量结果、体重、摄食量、检测报告、病理描述等）都必须准确、完整、及时地记录在案，确保可追溯性。
• 统计分析：
  • 对连续变量数据（体重、摄食量、器官重量、血液学、临床生化）进行统计学分析。
  • 常用方法包括方差分析（ANOVA）结合多重比较检验（如Dunnett's检验），或非参数检验（如Kruskal-Wallis结合Dunn's检验）。
  • 分类数据（发病率、病变发生率）常用卡方检验或Fisher精确检验。
  • 统计分析需考虑剂量反应趋势和性别差异。
• 结果解释与结论：
  • 综合分析所有观察终点（临床体征、体重、摄食量、功能观察、血液学、临床生化、尿液分析、大体解剖、器官重量、组织病理学）的结果。
  • 确定受试物的主要毒性效应及其特征（可逆性、进展性）。
  • 识别靶器官和毒性作用模式。
  • 确定关键的剂量水平：
    • NOAEL（未观察到有害作用水平）： 在该剂量水平下，未观察到与受试物处理相关的有害生物学效应。
    • LOAEL（最低观察到有害作用水平）： 在该剂量水平下，首次观察到与受试物处理相关的有害生物学效应。
  • 评估剂量-反应关系。
  • 讨论结果的生物学意义和潜在的人体健康风险。
• 研究报告：
  • 最终形成一份完整、详细、清晰的试验报告，内容需涵盖：
    • 摘要。
    • 引言（目的、受试物信息）。
    • 材料与方法（受试物、动物、饲养条件、试验设计、剂量选择依据、给药方案、观察指标与方法、统计分析计划）。
    • 结果（详细描述所有发现，附图表）。
    • 讨论（结果解释、与文献对比、确定NOAEL/LOAEL、鉴定靶器官）。
    • 结论（主要发现及其意义）。
    • 参考文献。
    • 附录（原始数据、病理报告、QA声明等）。

4. 良好实验室规范（GLP）要求

28天经口毒性试验通常在遵循良好实验室规范（Good Laboratory Practice, GLP） 的测试机构中进行。GLP是一套严格的质量管理体系，旨在确保：

• 试验的计划、执行、监督、记录、归档和报告的组织架构清晰。
• 人员具备资质并明确职责。
• 设施、设备和试剂符合要求并得到维护校准。
• 试验方案和标准操作规程（SOPs）完善并被遵循。
• 所有原始数据被准确完整记录。
• 最终的试验报告真实、完整、准确反映试验过程和结果。
• 有独立的质量保证部门（Quality Assurance Unit, QAU）对整个试验过程进行审核监督。 GLP合规性是试验数据被监管机构（如美国的FDA、EPA，欧盟的EMA、ECHA，中国的NMPA、MEE等）接受的关键前提。

5. 应用与局限性

• 应用：
  • 提供化学物质短期重复暴露毒性的核心数据集。
  • 为新药或化学品进入临床研究或市场提供重要的安全性支持。
  • 识别需要重点关注的目标器官，用于指导后续长期毒性、生殖毒性、致癌性等专项研究的设计。
  • 作为风险评估的基础，用于设定安全暴露限值。
• 局限性：
  • 物种外推： 动物实验结果外推到人类存在不确定性。
  • 短期性： 仅能检测28天内出现的毒性效应，可能无法预测慢性暴露或迟发性毒性。
  • 高强度暴露： 为识别潜在毒性，常使用远高于预期人体暴露水平的剂量。
  • 灵敏度限制： 可能无法检测某些细微的毒性效应（如轻度免疫功能改变、神经行为毒性）。

总结

28天经口毒性试验是评估化学物质在短期重复暴露下潜在健康危害的关键标准化试验。通过在受控环境下对大鼠进行为期28天的受试物给药，并系统监测从临床症状到组织病理学的广泛终点，该试验能够有效识别受试物的主要毒性效应、靶器官、剂量-反应关系，并得出关键的NOAEL和LOAEL。遵循GLP规范确保了试验数据的可靠性、完整性和可接受性。虽然存在物种外推和检测灵敏度等方面的局限性，但该试验提供的数据对于化学品和药品的安全性评价、风险评估和监管决策至关重要，并为后续更深入的安全性研究奠定坚实基础。

主要参考文献依据：

• OECD Guideline for Testing of Chemicals, No. 407: Repeated Dose 28-day Oral Toxicity Study in Rodents (Adopted: 3 October 2008).
• ICH Harmonised Guideline S4: Duration of Chronic Toxicity Testing in Animals (Rodent and Non-Rodent Toxicity Testing).
• Relevant national and regional regulatory guidelines (e.g., FDA Redbook, EPA OPPTS Harmonized Test Guidelines).