鼠伤寒沙门氏菌检测：方法与意义
一、引言
鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）是沙门氏菌属中最重要的血清型之一，广泛存在于家禽、家畜、野生动物以及环境中。它是引起人类食源性疾病（沙门氏菌病）的主要病原体之一，常通过污染的食物（尤其是禽肉、蛋类、奶制品）和水源传播。感染后可引起胃肠炎（症状包括腹泻、腹痛、发热、恶心呕吐），严重时可导致菌血症、肠热症样疾病甚至死亡，对公共卫生安全构成重大威胁。因此，快速、准确、灵敏地检测食品、环境样本及临床标本中的鼠伤寒沙门氏菌，对于保障食品安全、控制疾病传播、指导临床治疗和进行流行病学调查至关重要。
二、主要检测方法
鼠伤寒沙门氏菌的检测技术已发展多年，形成了从传统培养到现代分子生物学和免疫学技术的完整体系：
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传统培养法（金标准）
- 原理： 基于细菌的生长特性，利用选择性培养基抑制杂菌生长，促进目标菌生长，再通过生化反应和血清学鉴定确认。
- 步骤：
- 前增菌： 将待检样本（如食品匀液、粪便、环境拭子）接种到非选择性液体培养基（如缓冲蛋白胨水BPW）中，在37°C培养18-24小时。目的是复苏可能受损的细菌细胞并增加其数量。
- 选择性增菌： 取少量前增菌液转种到选择性液体培养基（如四硫磺酸钠煌绿肉汤TTB、亚硒酸盐胱氨酸肉汤SC）中，在37°C或42-43°C培养18-24小时。这些培养基含有抑制革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌的成分（如胆盐、煌绿、四硫磺酸钠、亚硒酸盐）。
- 选择性分离： 取选择性增菌液划线接种到选择性固体平板培养基（如木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂XLD、赫克通肠球菌琼脂HE、亚硫酸铋琼脂BS、沙门氏菌-志贺氏菌琼脂SS）上，在37°C培养18-48小时。鼠伤寒沙门氏菌在这些平板上通常呈现特征性菌落形态（如XLD上为粉红色带黑心；HE上为蓝绿色带黑心或完全黑色；BS上为有金属光泽的棕色或黑色菌落）。
- 生化鉴定： 挑取可疑菌落进行纯培养，然后接种到一系列生化反应管或使用商品化生化鉴定系统（如API 20E等）。鼠伤寒沙门氏菌典型的生化反应模式为：葡萄糖产酸产气（+）、乳糖不发酵（-）、蔗糖不发酵（-）、H2S产生（+）、尿素酶（-）、赖氨酸脱羧酶（+）、靛基质（-）、VP（-）、柠檬酸盐利用（+/-）。
- 血清学鉴定： 对生化反应符合沙门氏菌属特征的菌株，使用沙门氏菌多价O（体）抗血清和H（鞭毛）抗血清进行玻片凝集试验。鼠伤寒沙门氏菌通常属于O抗原群B群（1,4, , 12），其鞭毛抗原第一相为i，第二相为1,2。最终鉴定为Salmonella Typhimurium。
- 优点： 是国际公认的“金标准”，结果可靠，可分离获得活菌用于进一步分型（如噬菌体分型、药敏试验）或溯源。
- 缺点： 流程繁琐耗时，通常需要4-7天才能得出最终结果；对操作人员技术要求较高；灵敏度可能受样本中损伤菌或背景菌群影响。
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免疫学方法
- 酶联免疫吸附试验：
- 原理： 利用特异性抗体（捕获抗体）包被微孔板，捕获样本中的鼠伤寒沙门氏菌抗原（如菌体抗原、鞭毛抗原或特异性蛋白），再加入酶标记的二抗（检测抗体）与抗原结合，最后加入酶底物显色，通过测定吸光度值判断结果。
- 应用： 可用于检测增菌后样本中的抗原，实现高通量筛查，速度比传统培养法快（通常1-2天）。
- 优点： 相对快速，操作较标准化，可自动化。
- 缺点： 灵敏度不如培养法，可能受交叉反应影响出现假阳性或假阴性；检测的是抗原而非活菌；通常需要增菌步骤。
- 免疫磁珠分离技术：
- 原理： 将特异性抗体包被在磁性微珠表面，与样本混合后，抗体与目标菌结合，在外加磁场作用下将磁珠-细菌复合物从样本中分离富集出来。
- 应用： 主要用于复杂样本（如食品、粪便）中目标菌的快速富集和纯化，提高后续检测方法（如培养、PCR）的灵敏度和特异性。
- 优点： 有效富集目标菌，减少背景干扰，缩短检测时间。
- 缺点： 需要后续检测方法确认；抗体特异性影响效果。
- 胶体金免疫层析试纸条：
- 原理： 类似ELISA，但反应在试纸条上进行，通过标记物（胶体金）聚集产生肉眼可见的条带。
- 应用： 用于现场快速筛查（如临床样本、现场环境样本），几分钟到几十分钟内可出结果。
- 优点： 操作极其简便、快速、无需特殊设备。
- 缺点： 灵敏度较低，通常只能检测高浓度样本或增菌后样本，易出现假阴性；定性结果，需验证。
- 酶联免疫吸附试验：
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分子生物学方法
- 聚合酶链式反应：
- 原理： 针对鼠伤寒沙门氏菌特异的基因片段（如invA（侵袭基因）、ttr（四硫磺酸盐还原酶基因）、stn（肠毒素基因）以及血清型特异基因如fliB（鞭毛基因）或特异性序列）设计引物，通过变性-退火-延伸的循环扩增目标DNA片段。
- 常规PCR： 扩增后通过琼脂糖凝胶电泳检测特异性条带。通常用于增菌后样本。
- 实时荧光定量PCR：
- 在PCR反应体系中加入荧光标记的探针或染料（如SYBR Green），实时监测扩增产物量。
- 优点：灵敏度高、特异性强、速度快（数小时）、可定量（通过Ct值）、闭管操作减少污染风险。
- 应用：广泛用于食品、环境、临床样本的快速检测和定量。
- 多重PCR： 在同一反应体系中加入多对引物，同时检测多个靶基因（如沙门氏菌属基因+鼠伤寒沙门氏菌特异基因），提高效率。
- 优点： 特异性强、灵敏度高（可检测死菌或VBNC状态菌）、检测速度快（几小时到一天）、可实现高通量和自动化。
- 缺点： 设备昂贵；需要专业操作人员；不能区分死菌和活菌（除非结合前增菌或使用特殊染料）；可能受样本中PCR抑制物影响；对引物和探针设计特异性要求极高。
- 聚合酶链式反应：
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其他方法
- 噬菌体分型： 利用鼠伤寒沙门氏菌对特定噬菌体的敏感性差异进行分型，主要用于流行病学溯源，而非常规检测。
- 质谱技术： 如基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，通过分析细菌的蛋白质指纹图谱进行快速鉴定，通常用于纯菌落鉴定，速度快（几分钟），但需要先分离到纯菌。
- 生物传感器： 利用生物识别元件（抗体、适配体、受体）结合物理/化学换能器，检测目标物并产生信号，是快速检测的研究热点，但实际应用普及度仍在发展中。
三、方法选择与质量控制
- 方法选择依据： 检测目的（筛查、确证、定量）、样本类型、预期菌量、对速度和灵敏度的要求、实验室条件（设备、人员、成本）、法规要求（如食品检测标准）等。
- 质量控制至关重要：
- 阳性对照： 使用标准菌株（如鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028）验证检测体系有效性。
- 阴性对照： 使用非目标菌或空白样本排除假阳性。
- 内参： 在分子检测中加入内参基因或扩增控制，监测提取效率和抑制情况。
- 培养基质量控制： 定期测试培养基的选择性和促生长能力。
- 血清学试剂： 使用已知阳性/阴性菌株验证抗血清的特异性。
- 人员培训和标准化操作程序： 确保结果可靠性和可比性。
- 实验室间比对和能力验证： 评估实验室检测水平。
四、检测的意义
- 食品安全保障： 及时发现并控制受污染的食品，防止食源性疾病的爆发。
- 疾病诊断与控制： 快速准确诊断患者，指导合理使用抗生素和治疗；追踪传染源，控制疫情扩散。
- 流行病学调查： 确定传播途径、流行菌株特征（如耐药性、分型），为防控策略提供依据。
- 环境卫生监测： 评估水源、食品加工环境、养殖场等的卫生状况，及时发现污染源。
- 基础研究与药物开发： 为研究该菌的致病机制、耐药性、疫苗开发等提供基础。
五、结论
鼠伤寒沙门氏菌的检测技术已形成多元化格局。传统培养法作为金标准，其地位不可替代，尤其在需要获得活菌进行深入研究时。免疫学方法（如ELISA、胶体金试纸条）在快速筛查方面具有优势。分子生物学方法（尤其是qPCR）凭借其高灵敏度、高特异性和快速性，已成为常规检测和疫情应对中的重要工具。未来，随着技术的进步，更快速、更灵敏、更便携、能区分活菌死菌、并能实现现场检测的新方法（如基于CRISPR、新型生物传感器）将不断涌现并得到应用。无论采用何种方法，严格的质量控制是确保检测结果准确可靠的生命线。综合运用多种检测手段，结合有效的质量控制措施，是有效防控鼠伤寒沙门氏菌感染、保障公共卫生安全的关键所在。
参考文献 (示例格式，非实际引用)
- ISO 6579-1:2017. Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella — Part 1: Detection of Salmonella spp.
- U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella.
- World Health Organization. Guidelines for the control of typhoid and paratyphoid fever.
- 中国国家标准化管理委员会. GB 4789.4-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验.
- Malorny, B., et al. (2022). Salmonella detection: state of the art and future trends. Frontiers in Microbiology, 13, 1045226.