嗜中性粒细胞 NBT 还原试验

发布时间：2025-06-23 08:38:41 阅读量：2 作者：生物检测中心

嗜中性粒细胞硝基蓝四氮唑还原试验详解

概述 嗜中性粒细胞硝基蓝四氮唑还原试验是一种经典的功能性体外检测方法，主要用于评估嗜中性粒细胞在受到刺激后产生超氧阴离子等活性氧的能力，这项功能被称为“呼吸爆发”。它在诊断慢性肉芽肿病等原发性吞噬功能缺陷性疾病中具有重要作用。

一、 基本原理

  1. 核心反应： 水溶性淡黄色的硝基蓝四氮唑被嗜中性粒细胞吞噬后，在细胞内产生的超氧阴离子等活性氧的还原作用下，转化为不溶性深蓝色甲臜结晶。
  2. 功能指示： 甲臜结晶的形成和沉淀直接反映了细胞内 NADPH 氧化酶复合体（呼吸爆发氧化酶）的活性及其产生超氧阴离子的能力。
  3. 刺激物诱导： 孵育时加入刺激物（最常用佛波酯）活化细胞，模拟生理性吞噬过程，触发呼吸爆发。

二、 主要用途

  1. 诊断慢性肉芽肿病： 这是该试验最主要的临床应用。CGD 患者由于 NADPH 氧化酶基因缺陷，嗜中性粒细胞无法正常还原 NBT，结果为阴性或显著降低。
  2. 评估吞噬功能： 作为评估嗜中性粒细胞吞噬后杀菌功能的关键指标之一。
  3. 辅助诊断其他免疫缺陷： 有助于筛查可能存在吞噬细胞功能异常的疾病。
  4. 科研应用： 研究嗜中性粒细胞活化、氧化应激、药物治疗对呼吸爆发的影响等。

三、 试验材料与方法概要

  • 样本： 新鲜肝素抗凝外周静脉血。
  • 主要试剂：
    • 硝基蓝四氮唑溶液
    • 细胞刺激物：常用人工合成试剂（如佛波酯）
    • 孵育缓冲液（如磷酸盐缓冲液）
    • 瑞氏-吉姆萨染液或其他适合染白细胞的染液
    • 甲醇（固定用）
  • 主要器材： 显微镜、载玻片、盖玻片、温箱、微量加样器、离心机。
  • 基本操作步骤：
    1. 分离白细胞： 通常采用低渗溶血法去除红细胞，获取富含粒细胞的悬液。
    2. 孵育与刺激： 将细胞悬液、NBT 溶液、刺激物混合，在 37°C 下孵育一定时间（通常 15-30 分钟）。
    3. 终止与制片： 终止反应（如置于冰上），离心获取细胞沉淀，制备细胞涂片。
    4. 固定与染色： 甲醇固定涂片，瑞氏-吉姆萨染色。
    5. 镜检计数： 油镜下观察至少 100 个成熟嗜中性粒细胞。
      • 阳性细胞： 胞浆内含有深蓝色、粗大、点状或块状甲臜沉淀物。
      • 阴性细胞： 胞浆内无深蓝色沉淀物，胞浆呈淡粉红色或原有染色特性。

四、 结果判读

  1. 定性判读：
    • 阳性： 显微镜下可见清晰的深蓝色甲臜沉淀存在于嗜中性粒细胞胞浆内。
    • 阴性： 嗜中性粒细胞胞浆内无深蓝色甲臜沉淀形成。
  2. 半定量判读（更常用）： 计算阳性细胞的百分比。
    • 正常参考值： 通常 > 70-90% (具体范围实验室应根据自身条件和人群建立)。
    • 慢性肉芽肿病： 阳性细胞百分比通常显著降低甚至接近于 0%（尤其男性 X 连锁型）。
    • 携带者检测： 女性 X 连锁慢性肉芽肿病携带者通常呈现嵌合体现象（部分细胞阳性，部分阴性）。
  3. 报告形式： 通常报告 NBT 阳性细胞百分比 (%)。

五、 质量控制

  1. 样本新鲜度： 必须使用新鲜血液样本（最好在采血后 2-4 小时内完成试验），细胞活力直接影响结果。
  2. 试剂活性： NBT 溶液应新鲜配制或妥善保存，避免光照降解；刺激物需确保有效。
  3. 孵育条件： 严格控制温度（37°C）和时间。
  4. 内毒素控制： 所有试剂和耗材应无内毒素污染，以避免非特异性激活细胞。
  5. 对照设置：
    • 阳性对照： 使用已知健康人血液样本，确保试验系统正常。
    • 阴性对照： 使用已知慢性肉芽肿病患者样本（如可得），或省略刺激物（应基本无阳性细胞）。
    • 自发还原对照： 仅加 NBT，不加刺激物（阳性细胞应很低）。
  6. 操作标准化： 细胞浓度、试剂体积比例、离心速度等需标准化。
  7. 镜检者培训： 判读者需经过良好训练，能准确识别甲臜结晶形态和区分非特异性着色。

六、 临床意义

  • 显著降低或阴性： 是诊断慢性肉芽肿病的重要实验室依据。也可见于其他影响 NADPH 氧化酶活性或呼吸爆发的获得性或先天性缺陷（如严重的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症晚期）。
  • 正常或轻度降低： 通常提示嗜中性粒细胞的呼吸爆发功能基本正常。但在某些特定类型的慢性肉芽肿病或携带者中可能表现为接近正常或中度降低。
  • 动态监测： 对于已确诊患者，可用于评估治疗（如干扰素-γ）对细胞功能的改善效果。

七、 优缺点

  • 优点：
    • 原理直观可靠： 直接可视化细胞内呼吸爆发产物。
    • 成本相对较低： 所需主要试剂和设备在常规实验室较普遍。
    • 诊断金标准之一： 在 CG D 诊断中具有重要历史地位和临床价值。
  • 缺点：
    • 操作繁琐耗时： 涉及细胞分离、孵育、制片、染色、镜检计数等多个步骤。
    • 主观性： 显微镜计数存在一定主观性，依赖操作者经验。
    • 半定量： 不如流式细胞术等方法精确量化。
    • 样本要求高： 需新鲜样本，细胞活力至关重要。
    • 无法区分慢性肉芽肿病亚型： 需要基因检测进一步分型。

八、 注意事项

  1. 避免污染： 严格无菌操作，避免微生物和内毒素污染导致假阳性。
  2. 刺激物选择： 佛波酯是强效刺激物，有时会掩盖某些轻度缺陷。必要时可联合使用其他生理性刺激物（如调理颗粒）。
  3. 细胞形态识别： 确保准确计数成熟的嗜中性粒细胞，避免误计单核细胞（单核细胞还原 NBT 能力较低）。
  4. 识别假象： 注意区分真正的甲臜沉淀与染料沉渣等非特异性颗粒。
  5. 结果解释结合临床： 阳性率降低并非慢性肉芽肿病特有，需结合病史、感染特点、其他免疫学检查综合判断。确诊慢性肉芽肿病通常需要基因检测。
  6. 载玻片清洁： 使用洁净无油脂的载玻片，保证细胞涂片质量。

九、 展望 尽管二氢罗丹明 123 流式细胞术等更新、更快速、更灵敏、更定量的方法在评估嗜中性粒细胞呼吸爆发功能方面逐渐成为主流，NBT 还原试验因其经典性、直观性和相对经济性，在某些实验室（尤其资源有限地区）和特定研究场景中仍有应用价值。它是理解吞噬细胞氧化杀菌机制的重要工具。

参考文献

  1. Roos D, de Boer M. Molecular Diagnosis of Chronic Granulomatous Disease. Clin Exp Immunol. 2014.
  2. Segal BH, et al. Chronic Granulomatous Disease. In: Ochs HD, Smith CIE, Puck JM, eds. Primary Immunodeficiency Diseases: A Molecular and Genetic Approach. 3rd ed. Oxford University Press; 2014.
  3. 《临床实验诊断学》相关章节。
  4. 《全国临床检验操作规程》相关章节（方法学描述）。

请注意：具体操作步骤、试剂浓度的精确配比、孵育时间、阳性判断标准等细节需严格遵循所采用的标准操作规程。