淋巴因子产生试验 - 中析研究所生物检测中心

淋巴因子产生试验：原理、方法与意义

淋巴因子（Lymphokine），现多归入更广泛的“细胞因子”（Cytokine）范畴，主要是指由活化的淋巴细胞（特别是T淋巴细胞）分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质或多肽。它们在免疫应答中扮演着至关重要的信使角色，通过介导细胞间的通讯，调控免疫细胞的活化、增殖、分化、迁移和效应功能，是免疫系统协调一致对抗病原体、调节自身稳态的核心分子基础。淋巴因子产生试验（Lymphokine Production Assay）正是为了检测和评估特定条件下（如抗原刺激、细胞活化）淋巴细胞产生这些关键信号分子的能力而设计的体外实验方法。

一、实验目的与意义

评估免疫功能： 直接检测淋巴细胞（尤其是T细胞）在受到刺激后产生功能性细胞因子的能力，是评估个体细胞免疫功能状态的核心指标之一。功能低下可能提示免疫缺陷、免疫抑制状态或严重感染；功能亢进则可能与自身免疫病、过敏反应或慢性炎症相关。
研究免疫应答机制： 通过分析不同刺激条件（如特定抗原、有丝分裂原、单克隆抗体、共刺激分子）下产生的淋巴因子谱（Th1型：如IFN-γ, IL-2, TNF-α；Th2型：如IL-4, IL-5, IL-13；调节性T细胞相关：如IL-10, TGF-β等），可以深入了解免疫应答的类型（细胞免疫主导或体液免疫主导）、强度、调节机制以及不同免疫细胞亚群的功能特性。
疾病诊断与监测： 在某些免疫相关疾病（如原发性免疫缺陷病、某些自身免疫病、慢性感染）中，特定淋巴因子的产生能力可能作为辅助诊断或疾病活动度的监测指标。
疫苗与药物评价： 评估疫苗免疫后机体产生的抗原特异性T细胞反应（通过检测抗原刺激后产生的淋巴因子），或评价免疫调节药物、生物制剂对淋巴细胞功能的影响（如抑制或增强特定淋巴因子的产生）。

二、实验基本原理

淋巴因子产生试验的核心原理是：在体外模拟体内免疫应答的环境，通过适当的刺激物激活淋巴细胞，使其分泌淋巴因子。经过一定时间的培养后，收集培养上清液或裂解细胞，利用高灵敏度的检测技术定量或定性分析其中特定淋巴因子的含量或活性。

三、主要实验方法

根据检测目标和技术特点，常用的方法主要有以下几类：

酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）：
- 原理： 利用抗原-抗体特异性结合的原理。将针对待测淋巴因子的特异性捕获抗体预先包被在固相载体（如微孔板）上。加入待测样本（通常是细胞培养上清液）后，样本中的目标淋巴因子被捕获抗体结合。洗去未结合物质后，加入生物素或酶标记的特异性检测抗体（与捕获抗体识别目标分子的不同表位），形成“夹心”复合物。再次洗涤后，加入酶底物进行显色反应。颜色深浅与样本中目标淋巴因子的浓度成正比，通过标准曲线进行定量。
- 优点： 操作相对简便、标准化程度高、通量高、可定量、特异性好、灵敏度较高（可达pg/mL级）。
- 缺点： 只能检测单一因子；检测的是累积分泌量，不能反映单个细胞的分泌能力或分泌动态；无法区分产生该因子的细胞亚群。
酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked Immunospot Assay, ELISpot）：
- 原理： 是ELISA技术的延伸和改良。在包被了捕获抗体的微孔板孔内，直接加入待测淋巴细胞和刺激物进行培养。活化的淋巴细胞在分泌淋巴因子的瞬间，因子被其分泌点下方的捕获抗体立即捕获。培养结束后洗去细胞，加入生物素标记的检测抗体和酶标记的链霉亲和素（或直接酶标检测抗体），再加入底物显色。最终在细胞原来分泌因子的位置形成不溶性有色斑点（Spot）。每个斑点代表一个在培养期间分泌了该淋巴因子的活化淋巴细胞（称为斑点形成细胞，Spot-Forming Cells, SFC）。
- 优点： 能在单细胞水平上检测功能性淋巴因子分泌细胞（提供频率信息）；灵敏度高（可检测低频反应）；可同时进行多因子检测（使用多色底物或分孔检测）；结果直观（可视化的斑点）。
- 缺点： 操作步骤较ELISA复杂；对细胞活力和状态要求高；结果判读通常需要专门的仪器；定量精度略逊于ELISA（基于细胞计数）。
胞内细胞因子染色（Intracellular Cytokine Staining, ICS）结合流式细胞术（Flow Cytometry）：
- 原理： 在刺激物存在下培养淋巴细胞（通常需要加入蛋白质转运抑制剂如莫能菌素或布雷菲德菌素A，阻止新合成因子分泌，使其在胞内累积）。培养结束后，固定细胞以保持其结构，然后用透膜剂处理使细胞膜通透。加入荧光素标记的针对特定淋巴因子的抗体，抗体进入胞内与累积的因子结合。最后通过流式细胞仪检测细胞表面标记（如CD3, CD4, CD8, CD45RA等）和胞内淋巴因子的荧光信号。
- 优点： 能在单细胞水平上同时分析淋巴因子的产生与细胞表面标志物（精确鉴定产生因子的细胞亚群，如CD4+ T细胞亚群、CD8+ T细胞等）；可同时检测多种因子（多色流式）；提供细胞表型和功能状态的直接关联信息。
- 缺点： 操作复杂，步骤多；需要使用蛋白质转运抑制剂，可能影响细胞活力和功能；需要昂贵的流式细胞仪和专业分析软件；对样本处理和抗体选择要求高。
基于生物活性的检测（Bioassay）：
- 原理： 利用某些淋巴因子的特定生物学活性（如促进细胞增殖、抑制增殖、诱导细胞毒作用、抗病毒活性等），将其作用于相应的指示细胞系。通过测量指示细胞的反应（如增殖程度可用3H-TdR掺入或MTT法测定；细胞毒作用可用51Cr释放法测定；抗病毒活性可通过病毒蚀斑减少测定等）来间接反映样本中目标淋巴因子的活性水平。通常需要设置已知活性的标准品进行对照。
- 优点： 检测的是具有生物活性的因子，而非免疫反应性；在某些情况下灵敏度可能很高。
- 缺点： 操作繁琐、耗时长、通量低；特异性相对较差（其他具有相似活性的因子可能干扰）；需要维持特定的指示细胞系；结果受指示细胞状态影响大；难以精确定量。随着高特异性免疫学检测方法（ELISA, ELISpot, ICS）的发展，生物活性检测的使用已大幅减少。

四、实验关键步骤与注意事项

样本制备：
- 来源： 最常用的是外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs），通过密度梯度离心（如Ficoll-Hypaque）分离获得。也可使用脾脏、淋巴结、胸腺等组织来源的淋巴细胞或纯化的T细胞亚群。
- 细胞活力： 分离后的细胞活力应>90%，死细胞过多会影响结果。
- 细胞浓度： 根据所选方法和培养体系优化细胞浓度（如ELISA/ELISpot通常为0.5-2 x 10^6 cells/mL；ICS通常需要更高密度培养）。
刺激：
- 刺激物选择：
  - 有丝分裂原（Mitogens）： 如植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（Con A）、美洲商陆（PWM）。非特异性、多克隆激活剂，用于评估淋巴细胞整体的反应潜能。
  - 抗原（Antigens）： 如病原体特异性抗原（如结核菌素PPD、病毒肽段）、疫苗抗原、超抗原（如SEB）。用于检测抗原特异性T细胞反应，是评价疫苗效果或感染免疫状态的关键。
  - 抗CD3/CD28单克隆抗体： 模拟T细胞受体（TCR）和共刺激信号，广泛用于激活T细胞。
  - 细胞因子： 有时用于诱导特定亚群的分化或增强反应。
- 刺激时间： 不同淋巴因子分泌动力学不同。ELISA/ELISpot通常刺激24-72小时（累积分泌量）。ICS通常刺激4-6小时（加蛋白转运抑制剂后）。需根据目标因子和实验设计优化。
- 刺激浓度： 需预实验确定最佳刺激浓度，以达到有效激活且避免过度刺激或毒性。
培养条件：
- 培养基： 使用含适量血清（如5-10%胎牛血清）或血清替代物的完全培养基（如RPMI 1640, DMEM）。
- 培养环境： 37°C，5% CO2，饱和湿度培养箱。保持无菌操作。
- 培养容器： 根据方法选择（ELISA/ELISpot用平底96孔板；ICS常用圆底管或板）。
样本收集与处理：
- 上清液（ELISA/ELISpot）： 培养结束后，离心收集上清液，立即冻存于-20°C或-80°C（避免反复冻融）。
- 细胞（ICS）： 培养结束后直接处理细胞进行固定、透化和染色。或短暂冻存于特殊冻存液后再染色。
- 裂解液（某些ELISpot或分子检测）： 直接裂解孔内细胞。
检测：
- 严格按照所选方法（ELISA, ELISpot, ICS）的标准操作流程进行。包括试剂的配制、加样、孵育、洗涤、显色/荧光检测等。
- 务必设置合理的实验对照：
  - 阴性对照（NC）： 未刺激细胞（仅培养基）。用于确定背景水平。
  - 阳性对照（PC）： 强刺激物（如PHA/PMA+离子霉素）刺激的细胞。用于确认细胞具有反应能力。
  - 背景/空白对照： 仅培养基（无细胞）。用于校准仪器。
  - 标准品（ELISA/ELISpot）： 系列稀释的已知浓度重组淋巴因子，用于绘制标准曲线和定量。
  - 同型对照/荧光补偿对照（ICS）： 用于流式细胞术设门和排除非特异性染色。
数据分析：
- ELISA： 根据标准曲线计算样本中淋巴因子的浓度（如pg/mL）。通常报告刺激组浓度减去未刺激组浓度（净产生量）。
- ELISpot： 计数每孔斑点数量。报告每百万输入细胞中的斑点形成细胞数（SFCs/10^6 cells）。扣除未刺激孔的背景值（通常要求刺激孔显著高于背景）。
- ICS： 使用流式细胞术分析软件，圈定目标淋巴细胞群（如CD3+ T细胞），分析该群中淋巴因子阳性细胞的百分比（%阳性）和平均荧光强度（MFI，反映表达量）。报告刺激组减去未刺激组（或同型对照）的值。
- 统计分析： 根据实验设计和样本量选择合适的统计方法（如t检验、ANOVA）比较组间差异。