内毒素检查(凝胶限度法、动态浊度法、动态显色法)

发布时间：2025-06-23 08:38:41 阅读量：1 作者：生物检测中心
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内毒素检查方法详解

（凝胶限度法、动态浊度法、动态显色法）

一、概述

内毒素（Endotoxin）是革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖（LPS）成分，具有强致热性和免疫毒性。在药品、医疗器械及生物制品生产中，内毒素控制是保证产品安全性的核心指标。目前国际通用的检测方法基于**鲎试剂（Limulus Amebocyte Lysate, LAL）**的凝固或显色反应，主要包括以下三类：

二、检测方法原理与操作

1. 凝胶限度法（Gel-Clot Limit Test）
  • 原理： 内毒素激活鲎试剂中的凝固酶原级联反应，形成凝胶状凝固物。
  • 操作流程：
    1. 样品稀释至内毒素限值浓度以下。
    2. 鲎试剂复溶后与等体积样品混合，37°C恒温水浴60±2分钟。
    3. 倒转180°观察：形成固定凝胶为阳性；未凝固或无强度为阴性。
  • 结果判定： 通过系列内毒素标准品（如0.03、0.25、2.0 EU/mL）确定灵敏度（λ），样品需通过阴性对照及阳性对照验证。
  • 特点：
    • 半定量，结果直观；
    • 无需专用设备；
    • 易受操作干扰（如振动、温度波动）。
2. 动态浊度法（Kinetic Turbidimetric Assay）
  • 原理： 内毒素触发鲎试剂凝结反应，溶液浊度随时间增加，通过监测吸光度变化（340–660 nm）计算内毒素浓度。
  • 操作流程：
    1. 样品与鲎试剂在微孔板中混合，置入动力学检测仪。
    2. 连续监测吸光度变化至预设反应时间（通常15–60分钟）。
    3. 软件根据反应时间（T）或反应速度与标准曲线拟合定量。
  • 结果判定： 标准曲线需满足：相关系数|r|≥0.980，内毒素回收率50%–200%。
  • 特点：
    • 全定量检测；
    • 灵敏度高（可达0.001 EU/mL）；
    • 需精密光度检测设备。
3. 动态显色法（Kinetic Chromogenic Assay）
  • 原理： 内毒素激活鲎试剂中的凝固酶，切割人工合成显色底物（如Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA），释放黄色pNA（对硝基苯胺），在405 nm处检测吸光度增速。
  • 操作流程：
    1. 样品与含显色底物的鲎试剂混合，置入酶标仪。
    2. 连续监测405 nm吸光度变化速率（ΔmOD/min）。
    3. 通过标准曲线计算内毒素浓度（EU/mL）。
  • 结果判定： 标准曲线要求同动态浊度法；样品需通过干扰试验（稀释法或添加标准内毒素）。
  • 特点：
    • 高特异性，抗干扰能力强；
    • 适用于复杂基质（如血液制品、蛋白质溶液）；
    • 试剂成本较高。

三、方法学验证关键点

  1. 最大有效稀释倍数（MVD） MVD=内毒素限值（EU/mg或EU/mL）×样品浓度�（鲎试剂灵敏度）MVD=λ（鲎试剂灵敏度）内毒素限值（EU/mg或EU/mL）×样品浓度​ 注：样品稀释倍数不可超过MVD。

  2. 干扰试验

    • 样品需通过「未干扰」与「添加标准内毒素」两组回收率试验（50%–200%）。
    • 干扰存在时需进一步稀释或预处理（如调节pH、去除离子干扰）。

  3. 对照设置

四、方法选择与应用场景

五、法规与标准依据

  • 全球药典要求：
    • 《美国药典》〈85〉、〈151〉
    • 《欧洲药典》2.6.14
    • 《中国药典》1143
  • 核心规范：
    • 需使用经监管机构认可的鲎试剂；
    • 实验室应符合GLP/GMP环境控制要求。

六、注意事项

  1. 避免外源性内毒素污染（玻璃器皿需250°C干热≥30分钟）；
  2. 鲎试剂需在2–8°C保存，复溶后立即使用；
  3. 动态法需定期校准光度检测设备。

结论：凝胶法、浊度法、显色法构成内毒素检测的核心技术体系，各有适用场景。方法选择应基于产品特性、灵敏度需求及法规符合性，并通过严谨验证确保结果可靠性。

注：本文内容基于科学原理与药典要求撰写，不涉及任何特定品牌或商业实体。实验操作请严格遵循现行版药典及实验室SOP。