微生物限度检查与方法适用性验证

一、引言

在药品、医疗器械、化妆品、食品、原料及辅料的生产与质量控制中，微生物限度检查是一项至关重要的检验项目。其目的在于定量检测非无菌产品中需氧菌、霉菌和酵母菌的总数（微生物计数检查），并定性检测产品中是否存在特定的控制菌（如大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、耐胆盐革兰阴性菌等）（控制菌检查），以评估产品是否符合其微生物质量标准和卫生学要求，保障患者或使用者的安全。

然而，产品本身或其组分可能具有一定的抑菌性，可能抑制或杀灭样品中可能存在的微生物，导致检查结果偏低甚至呈假阴性。因此，为了确认所采用的检查方法能准确、可靠地检出产品中可能存在的微生物，必须在常规检查之前，或在产品配方、生产工艺、检验方法发生变更时，进行方法适用性验证（也称为方法学验证或回收率试验）。

二、微生物限度检查

微生物限度检查包含两个主要部分：

微生物计数检查：
- 目的： 测定单位重量、体积或面积供试品中所含需氧菌、霉菌和酵母菌的总数。
- 方法：
  - 平皿法：
    - 倾注法： 将规定量的供试液（通常1ml）注入无菌平皿中，再倾注温度不超过45℃的熔化的固体培养基，混匀，凝固，培养。
    - 涂布法： 将规定量的供试液（通常0.1ml或0.2ml）涂布于凝固的固体培养基表面。
  - 薄膜过滤法： 适用于溶于水或溶于特定溶剂的供试品，尤其适用于抑菌性强的供试品。将规定体积的供试液通过孔径不大于0.45μm的微孔滤膜过滤，然后用适量的冲洗液冲洗滤膜以去除残留的抑菌成分，最后将滤膜贴于适宜的固体培养基表面进行培养。
- 培养与计数：
  - 需氧菌总数： 通常使用胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA），在30~35℃下培养不少于3天（通常3~5天）。
  - 霉菌和酵母菌总数： 通常使用沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA），在20~25℃下培养不少于5天（通常5~7天）。
  - 计数所有平皿或滤膜上的菌落形成单位（CFU）。选择合适的稀释级，使菌落数适中（通常宜为20~300 CFU，霉菌和酵母菌可为5~100 CFU）。
- 结果计算： 根据各稀释级的平均菌落数、稀释倍数和供试品取用量计算每1g、1ml或10cm²供试品中含有的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数。
控制菌检查：
- 目的： 定性检查供试品中是否存在特定的、可能对健康构成威胁的指示菌或病原菌（如大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、耐胆盐革兰阴性菌等）。
- 方法： 通常包括增菌、分离、纯化和鉴定几个步骤。
  - 增菌： 将规定量的供试液或滤膜接种到特定的液体增菌培养基中，使目标菌（即使数量很少）得以增殖，同时抑制部分非目标菌生长。
  - 分离： 将增菌液划线接种到选择性或指示性固体平板培养基上，培养后根据菌落形态、颜色等特征挑选疑似目标菌菌落。
  - 纯化与鉴定： 挑取疑似菌落进行纯培养，并进行一系列生化试验、血清学试验或分子生物学试验进行确认鉴定。
- 结果报告： 报告在供试品的给定检验量中是否检出规定的控制菌（例如，“检出大肠埃希菌”或“未检出大肠埃希菌”）。

三、方法适用性验证

方法适用性验证是证明所采用的微生物限度检查方法（包括供试液制备、稀释、中和、过滤、冲洗、培养基选择、培养条件等）适用于待检产品的关键步骤。其核心目标是证明当产品中存在微生物时，该方法能够有效地将它们检出（即微生物能够生长并被计数或检出），不受产品本身抑菌活性的干扰。验证需针对微生物计数检查和控制菌检查分别进行。

验证目的：

证明供试品在该检验条件下无抑菌活性或抑菌活性已被有效消除/中和。
确保样品中可能存在的微生物能够在该方法设定的条件下生长并被检测出来。
保证检验结果的准确性、可靠性和重现性。

验证对象： 需对供试品进行验证。如果供试品需要溶解、分散或乳化在特定的稀释液或溶剂中制成供试液，则验证应基于该供试液进行。

验证用菌株： 通常使用以下代表菌株（需按规定进行传代和确认）：

计数方法验证：
- 需氧菌：金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)
- 霉菌和酵母菌：白色念珠菌 (Candida albicans)、黑曲霉 (Aspergillus niger)
控制菌检查验证： 使用相应控制菌的标准菌株（如大肠埃希菌验证用大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌验证用金黄色葡萄球菌）。

验证内容与步骤（以微生物计数检查为例）：

供试液制备： 按拟定检查方法制备供试液。
菌液制备： 将验证用菌株的新鲜培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌量约为50~100 CFU的菌悬液（菌悬液制备后应在2小时内使用）。
试验组： 取规定量的供试液（相当于1g, 1ml或10cm²样品），加入少量（通常不大于1ml）上述制备好的低浓度菌悬液，混匀。按拟定的计数方法（平皿法或薄膜过滤法）进行试验、培养、计数。这是模拟样品中实际存在微生物的情况。
菌液组： 取与“试验组”加入菌悬液等量的菌悬液（不含供试品），采用与供试品组相同的计数方法进行试验、培养、计数。此组代表理论上的微生物回收量。
供试品对照组： 取规定量的供试液（相当于1g, 1ml或10cm²样品），不加入菌液，按拟定的方法进行试验、培养、计数。此组用于检测供试品本身是否含菌。结果应无菌生长（若生长，说明产品已被污染，需调查原因）。
稀释剂/冲洗液对照组： 若方法中使用稀释剂溶解样品或冲洗液冲洗滤膜，应取与试验组所用等量的稀释剂或冲洗液，加入少量菌悬液，按相同方法试验、培养、计数。此组用于确认稀释剂/冲洗液本身无抑菌性。结果应与菌液组相当。
中和/去除抑菌性验证（关键步骤）：
- 若初步试验结果表明回收率低（见下判断标准），表明供试品存在抑菌性，需在方法中采取措施消除或中和抑菌性。
- 常见中和/去除方法：
  - 增加稀释度： 进一步稀释供试液，降低抑菌成分浓度（首选，简单有效）。
  - 增加冲洗量（薄膜过滤法）： 增加冲洗滤膜的次数和/或冲洗液总体积（例如100ml/膜增至300ml/膜或更多），充分洗去残留抑菌成分。
  - 使用中和剂： 在稀释液或冲洗液中加入适当的中和剂（如卵磷脂、聚山梨酯80用于中和表面活性剂和防腐剂；硫代硫酸钠用于中和含汞、含砷或含氯消毒剂；β-内酰胺酶用于中和青霉素类抗生素等），或使用含中和剂的培养基（如含β-内酰胺酶的TSA用于含青霉素样品）。
  - 薄膜过滤法结合中和剂： 在冲洗液中加入中和剂。
  - 其他方法： 离心沉淀集菌、酶处理等（需验证有效）。
- 采用选定的中和/去除方法后，必须重新进行完整的验证试验（试验组、菌液组、供试品对照组、稀释剂/冲洗液含中和剂对照组等），以确认抑菌性已被有效消除。

结果判断标准（微生物计数检查）：

试验组菌落数 / 菌液组菌落数 x 100% = 回收率(%)
合格标准（中国药典2020年版四部通则1105 & 1106）：
- 采用平皿法（倾注法、涂布法）时，试验组的菌回收率均不低于70%。
- 采用薄膜过滤法时，试验组的菌回收率均不低于70%。
- 若菌液组平均菌落数小于100 CFU，应将试验组和菌液组的菌落数分别换算为每1ml菌悬液的菌落数（乘以相应稀释倍数），再计算回收率。
控制菌检查验证： 试验组应能检出相应的控制菌，且阳性对照组（即菌液组）应生长良好，阴性对照组（如未加菌的培养基）应无菌生长。

验证结论：

若所有验证用菌株的回收率均达到标准（≥70%），且控制菌检查验证符合要求，则表明所采用的微生物限度检查方法适用于该供试品。
若某种菌的回收率未达标，表明该菌在该方法下被抑制，需按上述方法查找原因（抑菌性），修改方法（如增加稀释度、增加冲洗量、添加中和剂等），并重新进行验证，直至所有菌株均达标。
完整的验证过程和结果应形成书面报告存档。

四、方法适用性验证的重要性与质量控制

法规强制要求： 各国药典（如中国药典、美国药典USP、欧洲药典EP）和GMP规范均明确规定，进行微生物限度检查前必须进行方法适用性验证。
保证结果准确性： 是确保微生物限度检查结果真实反映产品微生物污染状况的关键屏障，避免因方法不适用导致的假阴性（漏检污染菌）或假阳性（误判）。
重现性与可靠性： 验证过的方法在不同时间、不同人员操作时应能得到一致、可靠的结果。
持续质量保证： 在产品生命周期内（处方、工艺、主要组分供应商变更，或定期如每年），应重新评估或重新进行方法适用性验证。
环境监控： 微生物限度检查需在受控的环境（如不低于D级的洁净区）下进行，并定期进行环境微生物监控，确保检验环境符合要求。
人员与记录： 操作人员需经过充分培训并考核合格。所有操作和结果均需详细、及时、准确地记录。

五、结论

微生物限度检查是保障非无菌产品微生物安全性的重要手段。然而，产品潜在的抑菌性是干扰检验结果准确性的主要因素。方法适用性验证通过科学严谨的实验设计，证明所采用的检验方法足以克服产品抑菌性，确保样品中可能存在的微生物能够被有效检出。它是微生物限度检查不可或缺的前置步骤和核心质量控制环节，是获得真实、可靠、具有法规符合性的微生物限度检验结果的基石。严格遵守验证流程和标准，是药品、医疗器械、化妆品等相关行业确保产品质量和公众健康的必然要求。