代谢稳定性（肝微粒体、S9、Cytosol、肝细胞、血液）

药物代谢稳定性评估：核心体外模型解析

在药物研发的长征中，理解化合物如何在体内被代谢清除至关重要。代谢稳定性评估不仅是化合物能否“存活”至靶点的关键预测指标，更是优化药代动力学（PK）特征的核心环节。本文将系统介绍评估代谢稳定性的五大体外模型体系：肝微粒体、肝S9组分、胞质溶胶（Cytosol）、原代肝细胞以及全血/血浆，深入剖析其原理、应用场景及优缺点。

一、 代谢稳定性：药物成败的关键门槛

代谢稳定性指化合物抵抗机体代谢酶降解的能力。稳定性差的药物：

• 清除过快：口服生物利用度低，需要频繁给药。
• 个体差异大：代谢酶（如CYP）的遗传多态性导致药效和毒性波动。
• 药物相互作用风险高：可能抑制或诱导代谢酶，影响联用药物的PK。

体外代谢模型通过模拟体内代谢环境，早期、快速、低成本地筛选高代谢稳定性候选物，指导化学结构优化。

二、 核心体外评估体系详解

1. 肝微粒体（Liver Microsomes）

   • 原理：肝细胞经匀浆、超速离心后获得的内质网碎片，富含Ⅰ相代谢酶（尤其是细胞色素P450超家族，CYP450）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT）等。
   • 应用：
     • Ⅰ相代谢主导稳定性评估：预测化合物被CYP酶氧化的速率。
     • CYP酶表型分析：鉴定负责代谢的主要CYP亚型（需配合选择性抑制剂或重组酶）。
     • UGT介导的葡萄糖醛酸化稳定性评估。
     • 体外-体内外推（IVIVE）：结合生理学参数预测体内清除率的基础模型。
   • 优点：制备相对成熟稳定；酶活性较高；成本较低；易于实现自动化高通量筛选。
   • 缺点：缺乏胞浆酶（如磺基转移酶SULT、谷胱甘肽S-转移酶GST、醛氧化酶AO）；缺乏完整的细胞膜结构（无法评估摄取/外排转运体影响）；缺乏辅助因子再生系统（需外源性添加NADPH等）；无法反映酶诱导效应。

2. 肝S9组分（Liver S9 Fraction）

   • 原理：肝组织匀浆液在9000g离心后的上清液，包含肝微粒体及胞质溶胶成分，囊括Ⅰ相（CYP450等）和Ⅱ相（UGT, SULT, GST等）代谢酶。
   • 应用：
     • 综合Ⅰ/Ⅱ相代谢稳定性评估：比微粒体更全面地模拟肝脏代谢。
     • Ⅱ相代谢主导化合物评估：如酚羟基化合物易被SULT代谢。
     • 代谢物谱初步鉴定：可同时观察到Ⅰ相氧化和Ⅱ相结合代谢物。
     • 某些特定Ⅱ相酶（如AO）活性研究。
   • 优点：同时包含Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶；成本低于完整肝细胞。
   • 缺点：酶浓度相对稀释（活性低于微粒体或胞质溶胶）；缺乏完整细胞结构（无转运体、生理屏障）；缺乏辅助因子再生系统（需同时添加NADPH和Ⅱ相所需辅因子如PAPS、UDPGA）；无法反映酶诱导效应。

3. 胞质溶胶（Cytosol）

   • 原理：肝细胞匀浆液经超速离心去除细胞器和微粒体后的可溶部分，主要包含水溶性Ⅱ相代谢酶（如SULT, GST, AO, 黄嘌呤氧化酶XO）、酯酶、酰胺酶以及某些还原酶。
   • 应用：
     • 特定Ⅱ相代谢酶稳定性评估：重点评估SULT、AO介导的代谢。
     • 水解稳定性评估：预测酯类、酰胺类化合物被胞浆酯酶/酰胺酶水解的速率。
     • 醛氧化酶（AO）底物鉴定与稳定性评估：AO在啮齿类动物中活性低，在人类中尤为重要。
   • 优点：是研究特定Ⅱ相代谢酶（尤其SULT、AO）和水解酶的专用体系。
   • 缺点：完全不包含Ⅰ相CYP450酶和UGT；缺乏完整细胞结构和转运体；水解酶活性可能因制备储存条件变化。

4. 原代肝细胞（Primary Hepatocytes）

   • 原理：从肝脏中分离得到的、保持完整结构和功能的肝实质细胞。包含所有肝内代谢酶（Ⅰ相、Ⅱ相）、转运体、辅因子及其再生系统、细胞核（可响应诱导信号）、生理性屏障（细胞膜）以及内源性调控机制。
   • 应用：
     • 最接近体内的综合代谢稳定性评估：提供最全面的代谢清除信息（酶+转运体）。
     • 酶诱导效应研究：可评估化合物对CYP3A4等关键酶诱导能力（需培养数天）。
     • 转运体介导清除研究：可考察肝细胞摄取和外排转运体对清除的贡献。
     • 复杂的代谢途径研究及代谢物谱生成。
     • 种属间代谢差异比较的理想模型。
   • 优点：包含完整的代谢酶系统和转运体系统；包含辅因子再生系统；可研究酶诱导；提供最接近生理环境的代谢清除评估。
   • 缺点：成本高昂；制备复杂，批间/供体间变异大；体外培养下酶活性随时间衰减较快（尤其悬浮细胞）；难以实现超高通量筛选。

5. 全血/血浆（Whole Blood/Plasma）

   • 原理：直接评估化合物在血液中的化学稳定性或酶促水解稳定性。血浆富含酯酶、酰胺酶、肽酶等水解酶；全血还包含红细胞中的酶。
   • 应用：
     • 水解稳定性评估：预测酯类、酰胺类、肽类或前药在血液循环中的稳定性。稳定性差可能导致失活或局部刺激。
     • 血浆蛋白结合率测定：虽非直接评估代谢，但与游离药物浓度相关，影响代谢速率。
     • 化学稳定性评估：如评估化合物在生理pH下的自发性降解。
   • 优点：直接反映化合物在体循环中的水解稳定性；样品易得；实验操作相对简单；对静脉注射或易受水解影响的药物设计尤为重要。
   • 缺点：仅评估血液相关的化学/水解稳定性，不反映肝脏代谢清除。

三、 模型选择与数据解读策略

• 早期高通量筛选（HTS）：常首选肝微粒体（侧重CYP稳定性）或肝S9（涵盖Ⅰ/Ⅱ相）。它们速度快、成本低、通量高。
• 深入表征优化化合物：
  • 关注CYP代谢：微粒体结合CYP表型分析。
  • 怀疑Ⅱ相代谢（如SULT、AO）：使用S9或胞质溶胶进行针对性研究。
  • 怀疑水解：使用胞质溶胶（胞内水解酶）和血浆/全血（循环水解酶）。
  • 追求最接近体内的综合评估及考察转运体/诱导：使用原代肝细胞（首选悬浮培养，或板式培养研究诱导）。
• 种属差异：必须使用目标种属（尤其是人） 的组织来源进行关键实验，以预测人体内清除。
• 整合数据：单一模型无法反映全部！需要整合不同模型数据：
  • 微粒体/S9稳定性好 ≠ 体内稳定性必然好（可能被转运体摄取后快速代谢，或受水解影响）。
  • 肝细胞稳定性差通常预示体内清除快。
  • 血浆稳定性差提示静脉注射或口服吸收后可能面临挑战。
• 结合体外清除率进行IVIVE：将微粒体/S9/肝细胞测得的固有清除率（CLint），结合肝脏血流量、蛋白结合率等生理参数，通过数学模型（如Well-Stirred Model）预测体内肝清除率（CLH）和全身清除率（CL），这是体外数据价值最大化的关键步骤。

结论

代谢稳定性是药物分子成药性的基石。肝微粒体、S9、胞质溶胶、原代肝细胞和全血/血浆构成了评估药物代谢命运的体外核心工具箱。每个模型各具优势与局限：

• 肝微粒体是CYP代谢的金标准。
• S9组分在Ⅰ/Ⅱ相代谢平衡性上更优。
• 胞质溶胶是水解及特定Ⅱ相代谢的探针。
• 原代肝细胞提供最接近生理的完整图景。
• 血液/血浆直接预警循环水解风险。

成功的候选药物开发依赖于科学、灵活地选择和组合这些模型，结合生理建模进行体外到体内的转化解读，从而在早期精准识别和优化代谢特性，显著提高药物研发的成功率。 理解代谢命运，方能驾驭药物在复杂生命体内的旅程。