免疫电泳试验：原理、技术与应用解析
免疫电泳试验是将琼脂凝胶电泳的高效分离能力与免疫沉淀反应的高特异性相结合的分析技术，主要用于复杂样本中抗原（如血清蛋白）的分离、鉴定与半定量分析。
核心原理
- 电泳分离：
- 待测样本（如血清）加入琼脂糖凝胶板的样品孔。
- 在恒定电场作用下，样本中各蛋白质组分依据其净电荷、分子大小和形状的不同，在凝胶中以不同的速率迁移，形成彼此分离的条带区域。
- 免疫扩散与沉淀：
- 电泳完成后，在凝胶板平行于电泳方向开一长条形抗体槽。
- 将已知的特异性抗血清（多克隆或多价抗血清） 加入抗体槽。
- 抗原（已分离的蛋白质）与抗体各自在凝胶中双向自由扩散。
- 当抗原与相对应的特异性抗体相遇，且达到适当的比例（等价带） 时，形成肉眼可见的不溶性免疫复合物沉淀线或沉淀弧。
核心技术类型
-
经典免疫电泳：
- 过程： 如上所述，先电泳分离，后加入抗体进行双向扩散形成沉淀弧。
- 结果判读： 观察沉淀弧的位置、形态、数量和强度。
- 位置： 反映抗原的电泳迁移率（如：位于α区、β区、γ区等）。
- 形态与数量： 异常形态（如：扭曲、拉长、分叉）或数量改变（如：额外弧、缺失弧）提示异常蛋白存在（如M蛋白）。
- 强度： 粗略反映抗原浓度（需结合其他定量方法）。
- 主要应用： 筛查和初步鉴定血清/体液蛋白异常（如多发性骨髓瘤的M蛋白检测），评估免疫球蛋白的多样性与缺失。
-
火箭免疫电泳：
- 原理： 抗原在含有均匀混有特异性抗体的琼脂糖凝胶中进行电泳。抗原向阳极迁移时，不断与凝胶中的抗体结合形成抗原抗体复合物。由于抗体浓度固定且过量，最终所有抗原在迁移路径上被沉淀耗尽，形成锥形（火箭形）沉淀峰。
- 定量基础： 在抗体浓度恒定、电场强度一致的条件下，火箭峰顶到加样孔中心的高度（或火箭峰的面积） 与样品中相应抗原的浓度成正比。
- 主要应用： 主要用于定量检测特定抗原（如单一蛋白成分），灵敏度高于经典免疫电泳定量。
关键实验要素
- 凝胶介质：
- 常用琼脂糖（纯度高、电渗低）。
- 浓度（通常1-2%）影响孔隙大小和分辨率。
- 缓冲系统：
- 维持稳定的pH值和离子强度对蛋白质迁移率至关重要（常用巴比妥、Tris-甘氨酸缓冲液）。
- 电泳槽缓冲液与凝胶缓冲液通常一致或离子强度不同（不连续系统）。
- 电场条件：
- 电压、电流、电泳时间需优化，以获得最佳的分离效果。
- 通常使用稳压稳流电泳仪。
- 抗体：
- 特异性与效价是关键。常用抗人全血清抗体（用于筛查）或针对特定蛋白（如抗IgG、抗IgA）的抗体。
- 抗体浓度需优化，过高导致沉淀线模糊或靠近抗体槽，过低则沉淀线弱或不出现。
- 抗原-抗体比例：
- 只有在等价带附近才能形成清晰致密的沉淀线/峰。比例不当时（抗原或抗体过量），沉淀减弱、溶解或位置偏移。
核心临床与应用价值
- 血清/体液蛋白异常筛查与鉴定：
- M蛋白病诊断（核心应用）： 是筛查和初步鉴定多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症等单克隆丙种球蛋白病的经典方法。可显示异常的、尖锐浓集的沉淀弧（M蛋白），伴随正常免疫球蛋白弧的减弱或消失。
- 低丙种球蛋白血症评估： 显示免疫球蛋白沉淀弧的普遍减弱或缺如。
- 多克隆高丙种球蛋白血症识别： 显示γ区弥漫增宽、浓集的沉淀弧。
- 补体成分、转铁蛋白、触珠蛋白等分析： 评估特定蛋白的缺失或异常。
- 抗原成分复杂性分析：
- 检测样本中是否存在特定的抗原成分及其大致迁移位置。
- 评估抗原的异质性。
- 抗体特异性初步验证：
- 用于验证自制抗血清是否能与目标抗原形成特异性沉淀线。
操作要点与注意事项
- 样本制备： 血清/体液需适当稀释（避免抗原过量）。
- 加样： 样品孔加样量需精确一致，避免溢出。
- 电泳参数： 严格按方法要求设置电压、电流、时间及冷却条件（防发热变形）。
- 抗体槽切割与加样： 槽需边缘整齐，抗体加注适量，避免溢出污染。
- 扩散孵育： 免疫扩散通常在湿盒中进行（防止凝胶干燥），保持恒温（室温或37°C），时间需充分（通常18-24小时）。
- 染色与脱色（提高灵敏度）：
- 常用考马斯亮蓝染色蛋白质沉淀线。
- 染色后需充分脱去背景颜色（脱色液浸泡），使沉淀线清晰可见。
- 结果观察与记录： 在良好光线下（尤其染色后）或在光密度扫描仪上观察并记录沉淀图谱。
方法学优势与局限
- 优势：
- 兼具分离与特异性识别能力。
- 可同时展示多种抗原组分及其免疫学特性。
- 设备要求相对简单（电泳仪、湿盒等）。
- 火箭电泳具有定量能力。
- 结果直观（沉淀线/弧/峰）。
- 局限：
- 灵敏度相对有限： 低于酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫分析（RIA）、化学发光等现代方法。
- 定量精度有限： 经典免疫电泳主要用于定性/半定量；火箭电泳定量优于前者，但仍不及ELISA等。
- 操作步骤多、耗时长： 电泳+扩散需过夜。
- 分辨率依赖优化： 抗原迁移率相近且浓度差异大时可能重叠。
- 结果判读需经验： 沉淀弧形态解读具有一定主观性。
总结
免疫电泳试验作为一种经典的免疫化学分析技术，通过巧妙结合电泳分离与免疫沉淀原理，为研究者提供了在复杂混合物中可视化特定抗原组分的有力工具。尽管其灵敏度和定量精度已被更新的免疫分析方法超越，但在**血清蛋白异常的筛查与初步鉴定（特别是M蛋白检测）**领域，凭借其直观性和同时分析多种成分的能力，仍具有重要的应用价值，尤其作为免疫固定电泳等更灵敏方法的补充或初筛手段。理解其原理、掌握操作要点并认识其优缺点是有效利用该技术的关键。