免疫沉淀试验 - 中析研究所生物检测中心

免疫沉淀（IP）实验：原理、步骤与应用详解

一、实验原理

核心机制：抗体与目标抗原（靶蛋白）特异性结合。
载体复合物：抗体预先或同时与固相基质（如琼脂糖或磁珠）偶联，形成“抗体-基质复合物”。
捕获与分离：抗原-抗体复合物通过基质固相化，经离心或磁力分离，去除样品杂质。
洗脱与分析：目标蛋白被洗脱后，可通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白质印迹（Western Blot）、质谱（MS）等技术进行检测或鉴定。

二、主要实验类型

三、关键试剂与缓冲液（无商品名）

裂解缓冲液(Lysis Buffer)：
- 基础成分：50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40 或 Triton X-100
- 关键添加剂：蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂（根据研究需求）、EDTA
洗涤缓冲液(Wash Buffer)：
- 常用配方：50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.1% NP-40
- 高严谨性缓冲液：添加 300-500 mM NaCl 或 0.1% SDS（需优化）
洗脱缓冲液(Elution Buffer)：
- 变性洗脱：1X SDS-PAGE 上样缓冲液（含 2% SDS, 100 mM DTT, 煮沸）
- 温和洗脱：低 pH 甘氨酸溶液 (pH 2.5-3.0) 或高 pH Tris 溶液 (pH 8.0-9.0)，立即中和
抗体结合基质：预处理好的琼脂糖微球或磁珠（如 Protein A/G 偶联微球）
特异性抗体：优化的免疫沉淀级单克隆或多克隆抗体

四、标准实验流程（间接法/Co-IP）

样品前处理：
- 收集细胞或组织，用预冷的 PBS 漂洗。
- 加入适量预冷的裂解缓冲液（含蛋白酶/磷酸酶抑制剂），冰上孵育 15-30 分钟。
- 4°C，14,000 x g 离心 15 分钟，收集上清（总蛋白裂解液），测定浓度。
预清除（推荐）：
- 取适量裂解液 + 空白基质微球，4°C 旋转孵育 30-60 分钟。
- 离心去除基质，减少非特异性结合。
抗体-基质复合物制备：
- （可选）抗体与基质预孵育：抗体 + 基质微球 + 孵育缓冲液，4°C 旋转孵育 1-2 小时。
- 洗涤基质微球 2-3 次去除未结合抗体。
免疫沉淀反应：
- 预清除后裂解液 + 抗体（或抗体-基质复合物）。
- 4°C 旋转孵育过夜（最佳结合效率）或 2-4 小时。
捕获复合物：
- 若未预偶联抗体：加入充分洗涤的基质微球（Protein A/G），4°C 旋转孵育 1-2 小时。
- 离心收集基质微球（或磁力分离磁珠）。
严格洗涤：
- 沉淀物用 1 mL 预冷洗涤缓冲液轻轻重悬。
- 离心/磁分离去除上清。
- 重复洗涤 4-6 次（关键步骤）。
目标蛋白洗脱：
- SDS-PAGE/WB 分析：加入适量 1X SDS-PAGE 上样缓冲液，煮沸 5-10 分钟。
- 质谱/功能分析：使用温和洗脱缓冲液（如低 pH 甘氨酸），立即中和。
下游检测：
- SDS-PAGE 分离 → Western Blot 鉴定目标蛋白或互作蛋白。
- 质谱分析鉴定复合物组分。
- 酶活检测等功能研究。

五、关键优化点与问题排查

六、质量控制要点

阴性对照：必须设置！
- 同型对照 IgG：使用与实验抗体同种属、同亚型的非特异性抗体平行实验。
- 空白基质对照：仅用基质微球处理样品（检测基质非特异吸附）。
阳性对照：使用已知表达目标蛋白的细胞系或组织裂解液。
输入对照(Input)：保留部分原始裂解液（通常占 IP 用量的 1-10%），用于检测样品中目标蛋白总量。
洗涤充分性：最后 1-2 次洗涤缓冲液应进行蛋白浓度检测，确保无残留。