免疫学特性测定

免疫学特性测定：揭示免疫系统的精密蓝图

免疫学特性测定是一系列精密实验技术的集合，旨在全面解析生物体免疫系统的组成、状态、功能及其对外界刺激（如病原体、疫苗、药物或疾病状态）的响应能力。其核心目标是描绘免疫系统在特定时间点的“免疫图谱”，为疾病诊断、预后评估、疫苗研发、免疫治疗及基础免疫学研究提供不可或缺的科学依据。以下是对关键测定领域的系统阐述：

一、 细胞免疫特性测定：解析免疫大军构成与战斗力

细胞免疫评估聚焦于各类免疫细胞（尤以T细胞、B细胞、NK细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞等为核心）的数量、表型、活化状态及功能活性。

1. 免疫细胞分型与计数：

   • 流式细胞术： 核心技术。利用能与细胞表面或胞内特定分子（CD分子、细胞因子、转录因子等）特异性结合的荧光标记抗体，对混合细胞群体进行多参数（可达数十种）同时分析。可精确鉴定不同细胞亚群（如CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞、B细胞亚群等）的比例和绝对数量。
   • 免疫组织化学/免疫荧光： 在组织切片或细胞涂片上原位检测特定免疫细胞的分布、数量及空间关系，提供组织微环境中的免疫景观信息。

2. 细胞功能活性评估：

   • 增殖能力检测：
     • CFSE稀释法： 使用荧光染料CFSE标记细胞，细胞分裂时染料平均分配至子代细胞，荧光强度减半，通过流式细胞术追踪细胞分裂次数和比例。
     • ³H-胸苷/BrdU/EdU掺入法： 细胞增殖时摄入标记的核苷类似物，通过检测放射性或荧光信号反映增殖水平。
   • 细胞毒性检测： 评估效应细胞（如CD8+ T细胞、NK细胞）杀伤靶细胞的能力。常用方法包括：
     • 铬释放试验： 用放射性铬标记靶细胞，效应细胞杀伤导致铬释放，检测上清放射性强度。
     • 荧光染料标记法： 用荧光染料标记靶细胞，检测效应细胞杀伤后释放的荧光强度。
     • 流式细胞术检测凋亡/坏死： 使用Annexin V/PI等染料区分靶细胞的凋亡和坏死状态。
   • 细胞因子分泌能力： 评估细胞受刺激后产生细胞因子的能力。
     • 胞内因子染色： 刺激细胞后，使用蛋白转运抑制剂阻断因子分泌，再用荧光抗体对胞内因子进行染色，通过流式细胞术检测分泌特定因子的细胞频率。
     • 酶联免疫斑点试验： 将细胞置于包被有捕获抗体的膜上培养，细胞分泌的因子被捕获在局部形成斑点，计数斑点反映分泌该因子的细胞频率。
   • 信号通路活化分析： 使用流式细胞术检测磷酸化蛋白（如pSTATs, pERK等），评估细胞信号通路的激活状态。

二、 体液免疫特性测定：解码抗体防御体系的密码

体液免疫评估主要针对B细胞产生的抗体（免疫球蛋白），分析其特异性、滴度、亲和力、类别转换情况及功能。

1. 抗体特异性与滴度检测：

   • 酶联免疫吸附试验： 最广泛应用的技术。将目标抗原包被于固相载体，加入待测血清，若存在特异性抗体则结合，再通过酶标记的二抗和底物显色进行定量或半定量检测，确定抗体滴度。
   • 免疫印迹： 常用于复杂抗原（如病原体裂解物）的抗体特异性确认。抗原经电泳分离并转印至膜上，与血清孵育后显色，观察条带位置判断识别抗原。
   • 免疫沉淀： 用于分离和研究与特定抗体结合的抗原复合物。
   • 免疫荧光/免疫组化： 用于检测组织或细胞中特定抗原的抗体结合情况。

2. 功能性抗体检测：

   • 中和抗体试验： 至关重要。 评估抗体阻断病原体（主要是病毒）感染靶细胞的能力。
     • 传统中和试验： 将血清/抗体与活病原体预孵育后感染细胞，通过观察细胞病变效应或检测感染标记物（如抗原表达）判断中和效果。
     • 假病毒中和试验： 使用表达目标病毒囊膜蛋白但缺陷的假病毒，安全性更高，常检测针对特定病毒（如HIV, SARS-CoV-2）的中和抗体。
     • 报告基因中和试验： 假病毒携带报告基因，感染后通过检测报告基因表达量定量中和效力。
   • 抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用检测： 评估抗体结合靶细胞后，通过其Fc段招募NK细胞等效应细胞杀伤靶细胞的能力。
   • 抗体依赖的细胞介导的吞噬作用检测： 评估抗体结合病原体或靶细胞后，促进吞噬细胞吞噬清除的能力。
   • 补体依赖的细胞毒作用检测： 评估抗体结合靶细胞后激活补体系统导致细胞裂解的能力。

3. 抗体亲和力/亲合力测定：

   • 表面等离子共振： 实时监测抗体与固定在芯片上抗原的结合与解离动力学，计算亲和力常数。
   • 酶联免疫吸附试验改良法： 利用洗脱液（如尿素、硫氰酸盐）处理抗体-抗原复合物，测量抵抗洗脱而保持结合的抗体比例，反映抗体亲和力成熟程度或亲和力相对高低。

4. B细胞受体谱分析： 利用高通量测序技术分析B细胞受体基因（BCR）的多样性、克隆扩增情况和突变模式，揭示B细胞库的组成和动态变化，常用于自身免疫病、感染免疫和肿瘤免疫研究。

三、 分子与系统水平特性测定：洞察免疫应答的深层机制

1. 细胞因子与趋化因子谱分析：

   • 多重微球免疫分析： 使用不同荧光编码的微球，每种微球包被捕获特定因子的抗体，单次实验可同时定量数十种细胞因子/趋化因子，高效描绘免疫应答的“细胞因子风暴”或特征谱。
   • 基于芯片的检测： 在固相芯片上固定多种抗体，实现高通量因子检测。
   • 单分子检测技术： 提供超高灵敏度。

2. 主要组织相容性复合体分型：

   • 血清学分型： 传统方法，基于抗体介导的补体依赖细胞毒作用判定白细胞表面HLA抗原。
   • 分子生物学分型： 当前金标准。通过PCR-SSP、PCR-SSO、SBT或NGS等技术，直接分析个体的HLA基因序列，获得高分辨率的HLA型别信息，对器官/造血干细胞移植配型、强相关自身免疫病风险评估至关重要。

3. 免疫相关基因表达谱分析：

   • 实时定量PCR： 定量检测特定免疫相关基因的mRNA表达水平。
   • 微阵列： 同时检测大量基因的表达。
   • RNA测序： 提供全转录组水平的无偏倚分析，揭示差异表达基因、可变剪接、新转录本等，深入理解免疫应答的分子调控网络。

四、 技术选择与应用考量

免疫学特性测定的选择取决于核心科学问题：

• 目标： 是评估整体免疫状态、特定细胞功能、抗体反应、分子机制，还是寻找生物标志物？
• 样本类型与量： 全血、外周血单个核细胞、血清/血浆、组织、细胞培养上清？
• 灵敏度与特异性要求： 低丰度目标需要高灵敏度方法。
• 通量需求： 大规模筛查需要高通量平台。
• 定量/定性需求： 需要绝对定量、相对定量还是存在性检测？
• 资源与技术平台： 可用设备、试剂、人员专业水平。

五、 总结与前景

免疫学特性测定构成了现代免疫学研究和应用的基石。从精细刻画免疫细胞的表型与功能，到全面解析抗体应答的特异性和效力，再到深入探索调控免疫反应的分子信号网络，这些技术使我们得以窥探免疫系统的复杂性与动态性。随着单细胞多组学技术（转录组、蛋白组、表观组等）、高参数流式细胞术、多重空间成像技术、微流控芯片、人工智能辅助分析等前沿领域的飞速发展，免疫学特性测定正朝着更高维度、更高分辨率、更高通量和更具整合性的方向迈进。这不仅将极大深化我们对免疫生理与病理的理解，更将有力地推动精准医疗、新型疫苗设计和个体化免疫治疗的发展，最终惠及人类健康。

值得注意的是，进行免疫学特性测定研究需严格遵守伦理规范，获取知情同意，妥善处理生物样本，并在符合资质的实验环境中由专业人员操作，以确保结果的可靠性和科学性。