无菌试验：守护产品无菌屏障的关键质量控制
在药品、生物制品、医疗器械及某些高风险食品的生产中，“无菌”是一项至关重要的质量属性，直接关系到使用者的生命安全。无菌试验（Sterility Test）作为产品质量控制的最后一道防线之一，其核心目标就是通过微生物学方法，检测批产品中是否存在存活微生物，从而判定该批产品是否符合无菌要求。
一、 定义与核心目标
- 定义： 无菌试验是指在严格受控的无菌条件下，将一定量的产品或产品溶液接种到适宜的微生物培养基中，在规定的温度和时间内进行培养，观察是否有微生物生长的一种检查方法。
- 核心目标： 确认经过灭菌工艺处理后（如最终灭菌或无菌生产工艺）的批次产品，在放行时是否达到其声称的无菌状态标准。
二、 法规与标准依据
无菌试验的实施必须严格遵循相关法规和权威药典的要求，全球主要依据包括：
- 《中国药典》（ChP）通则 1101 “无菌检查法”
- 《美国药典》（USP）通则 <71> “Sterility Tests”
- 《欧洲药典》（EP） 2.6.1. “Sterility”
- 国际人用药品注册技术协调会（ICH）指导原则（如Q4B、Q6A等涉及无菌保证）
- 医疗器械相关标准（如ISO 11737-2:2019 Sterilization of health care products — Microbiological methods — Part 2: Tests of sterility performed in the definition, validation and maintenance of a sterilization process）
这些标准详细规定了试验方法、培养基、培养条件、样品量、结果判断标准以及严格的试验环境要求。
三、 核心方法学
药典主要规定了两种基本方法，选择依据是产品的性质和溶解度：
-
薄膜过滤法（Membrane Filtration Method）：
- 原理： 将规定量的供试品溶液通过孔径不大于0.45微米的薄膜过滤器过滤。目标微生物被截留在滤膜表面。然后用适量的无菌冲洗液冲洗滤膜（去除抑菌性）。最后，将滤膜剪成适当份数，分别转移至含硫乙醇酸盐流体培养基（用于需氧菌和厌氧菌，培养温度通常为30-35°C）和胰酪大豆胨液体培养基（用于霉菌和需氧菌，培养温度通常为20-25°C）的容器中。
- 适用性： 该方法是首选方法，尤其适用于水溶性供试液、油性液体、可溶于水或有机溶剂且不抑菌或抑菌性可去除的固体供试品（如注射液、滴眼液、无菌粉末、医疗器械冲洗液等）。其优势在于可以处理较大样品量，并通过冲洗有效去除抑菌成分。
-
直接接种法（Direct Inoculation Method）：
- 原理： 将规定量的供试品直接分别接种至两种无菌培养基（硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基）容器中。
- 适用性： 主要用于无法采用薄膜过滤法或过滤困难的供试品，例如：
- 油性制剂： 难以过滤。
- 抑菌性强的供试品： 即使冲洗也难以完全去除抑菌性。
- 外科用敷料等医疗器械： 可将样品直接浸入培养基中。
- 容器装置： 将培养基直接加入容器（如预充式注射器）中培养。
- 局限性： 样品量相对受限，对于抑菌性强的产品，即使存在微生物也可能被抑制而不生长，导致假阴性风险增加，常需结合中和法或稀释法。
四、 试验的核心前提：无菌环境与无菌操作
无菌试验必须在最高级别的无菌环境中进行，结果的可靠性高度依赖于环境控制：
- 环境要求： 通常在符合洁净度要求的**无菌检查隔离器（Isolator）或B级背景下的A级单向流洁净操作台（Laminar Air Flow Cabinet）**内操作。环境需定期进行悬浮粒子、沉降菌、浮游菌、表面微生物监测，并进行高效空气过滤器（HEPA）完整性测试。
- 操作要求： 试验人员需经过严格的无菌操作技术培训，穿戴无菌工作服（如连体服、手套、口罩、头罩）。所有操作必须极其谨慎，最大限度减少操作引入污染的风险。
五、 培养基与培养
- 培养基种类与目的：
- 硫乙醇酸盐流体培养基（Fluid Thioglycollate Medium - FTM）： 主要用于检测需氧菌和厌氧菌。其成分设计（如硫乙醇酸盐、刃天青指示剂）可在容器内形成氧化还原梯度，同时支持需氧菌（在培养基上部）和厌氧菌（在培养基底部）的生长。培养温度：30-35°C，至少培养14天。
- 胰酪大豆胨液体培养基（Tryptic Soy Broth - TSB / Soybean-Casein Digest Medium - SCDM）： 主要用于检测霉菌和需氧菌。培养温度：20-25°C，至少培养14天。
- 培养基无菌性及促生长能力验证： 每次试验前或定期，必须验证：
- 无菌性： 取部分培养基在相同条件下培养，应无菌生长。
- 促生长能力（Sterility Test Growth Promotion / Fertility Test）： 用少于100 CFU（菌落形成单位）的6种代表性试验菌株（通常包括：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉）分别接种到少量培养基中，在规定时间内应观察到明显的微生物生长。这是证明培养基支持微生物生长能力的关键验证。
六、 结果观察与判定
- 观察周期： 在整个规定的培养期（通常不少于14天）内，需定期（如第3、5、7、14天或按药典规定）观察所有培养基容器。
- 结果判定标准（依据药典）：
- 符合规定（无菌检查通过）： 若所有培养基容器在培养期间均澄清（或虽有浑浊但确证非微生物生长所致），判供试品的无菌检查符合规定。若培养基浑浊，需转种确认（接种至新鲜同种培养基和营养琼脂斜面，观察是否生长及形态）或革兰氏染色镜检。
- 不符合规定（无菌检查未通过）： 若任一培养基容器在培养期间呈现确证由微生物生长引起的浑浊，判供试品的无菌检查不符合规定。
- 复试与调查： 若试验无效（如阳性对照不长、无菌检查或促生长能力验证失败）或结果不符合规定，需严格按照药典规定进行调查。调查应全面审查试验过程（环境监控数据、操作记录、培养基验证、设备状态、人员操作等），确定污染来源（是产品本身还是试验过程引入）。只有在充分证据证明初始失败源于试验过程差错，且调查结论支持时，才允许按规定进行复试（Retest）。复试的样品量和检验数量通常会增加（如在原抽样量基础上加倍）。一次不符合规定通常不能仅依靠复试结果推翻，需综合判断。
七、 方法适用性试验（抑菌性去除验证）
这是无菌试验设计和执行中的关键环节。
- 目的： 确认所采用的无菌检查方法（特别是冲洗步骤、稀释、中和剂使用等）能有效消除供试品本身或其溶液可能具有的抑菌活性，确保即使样品中含有微生物，其在试验条件下也能被检出，避免假阴性结果。
- 方法： 在供试品（或溶液）中加入少于100 CFU的6种代表菌株（同促生长能力验证菌株），然后按拟定的无菌检查法进行操作（包括可能的冲洗、过滤、接种等）。同时设置阳性对照组（仅接种菌株）和供试品对照组（仅加供试品）。
- 标准： 试验组与阳性对照组相比，各试验菌株均应生长良好（通常在3天内与阳性对照生长相当）。供试品对照组应无菌生长。若试验组微生物生长被抑制，说明方法无效，需修改方法（如增加冲洗量、使用中和剂、改用直接接种法并加大稀释、更换更优的培养基等）并重新进行适用性试验，直至通过。
八、 重要性、局限性及与其他手段的结合
- 重要性： 无菌试验是成品放行前验证其无菌性的法定强制性测试，是保障患者使用安全的直接手段之一。
- 局限性（概率性检测）：
- 无菌试验本质上是基于统计学抽样的小样本检测（如注射剂通常取20个最小包装单位）。即使产品合格（污染率极低），也存在小概率事件导致污染单元未被抽到的可能（假阴性风险）。
- 反之，试验过程的污染（假阳性）也可能导致合格批次被错误判定为不合格。
- 它无法检测所有类型的微生物（如病毒、专性胞内寄生菌、极端环境微生物通常不被涵盖）。
- 抑菌性强的产品检测难度大，方法适用性验证至关重要。
- 与无菌保证体系的结合： 鉴于上述局限性，不能仅依赖无菌试验来保证产品无菌。无菌保证是一个系统工程，必须建立在：
- 严格的GMP（药品生产质量管理规范）体系
- 经过充分验证、受控的灭菌工艺（如湿热灭菌、干热灭菌、辐射灭菌、环氧乙烷灭菌、过滤除菌）或无菌生产工艺（APIS）
- 完善的工艺监控（如灭菌过程参数监控F0值、生物指示剂挑战）
- 良好的无菌操作规范和环境控制（洁净室/隔离器）
- 密封完整性测试（Container Closure Integrity Testing）
- 科学合理的取样计划
- 无菌试验是这一整套体系中的重要组成部分和最终确认手段之一。
九、 结论
无菌试验作为一项高度专业化、严格受控的微生物学检测技术，在确保无菌产品质量和患者安全方面扮演着不可替代的角色。其成功实施依赖于对法规标准的深刻理解、对方法学原理的精准把握、对无菌操作环境的严格控制、对培养基性能的严格验证以及对方法适用性的充分确认。认识到其固有的统计学局限性，并将其置于整个无菌保证体系中进行理解和应用，才能真正发挥其作为质量控制关键屏障的作用。持续的技术发展（如快速微生物检测技术RMM）旨在提高检测效率和可靠性，但其应用仍需经过严格的验证并符合法规要求。无菌试验的核心价值，始终在于为每一批放行的无菌产品提供一份基于科学验证的无菌状态证明。