细菌内毒素的检测

发布时间：2025-06-21 14:07:22 阅读量：4 作者：生物检测中心

细菌内毒素检测：原理、方法与质量控制

细菌内毒素，又称脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS），是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜的主要成分。当细菌死亡溶解或细胞分裂时，内毒素会释放进入周围环境。由于其极强的生物学活性，极小剂量的内毒素进入人体血液循环系统即可引发发热（热原反应）、炎症、休克甚至多器官衰竭等严重病理反应。因此，在药品（特别是注射剂、生物制品、医疗器械）、医疗器械（植入物、体外循环器具等）、生物制剂、细胞治疗产品及某些化工产品的生产和质控中，细菌内毒素检测是一项关乎产品安全性和有效性的强制性关键质控项目。

一、 内毒素的特性与危害

  1. 热原性： 是引起机体发热反应最强的物质之一。
  2. 化学稳定性： 耐高温（例如，常规的高压蒸汽灭菌法121℃ 30分钟无法完全破坏其活性）、耐强酸强碱，普通的灭菌方法难以有效去除。
  3. 普遍存在性： 广泛存在于自然界，尤其是水源、尘埃、空气及许多原材料中。
  4. 生物活性强： 极微量（纳克/公斤体重级别）即可激活人体免疫系统，引发剧烈的炎症级联反应。

危害主要体现在：

  • 药品/医疗器械： 注射给药后可能引起患者发热、寒战、血压下降甚至休克死亡。
  • 生物制品： 可能干扰产品本身活性或引起不良反应。
  • 透析液/冲洗液： 直接接触血液或体腔，内毒素超标后果严重。

二、 检测原理：鲎试验（Limulus Amebocyte Lysate Test, LAL Test）

目前国际上公认并广泛使用的细菌内毒素检测方法，均基于鲎试剂（Limulus Amebocyte Lysate, LAL）。鲎（一种古老的海洋节肢动物，俗称马蹄蟹）的血液中含有一种特殊细胞——阿米巴样细胞。这些细胞中含有对细菌内毒素极其敏感的凝血系统原酶。

  • 核心原理： 当内毒素与鲎试剂接触时，会激活鲎血细胞裂解物中的一系列酶原（主要是C因子、B因子、凝固酶原），通过级联放大反应，最终促使凝固蛋白原转化为凝胶状的凝固蛋白。这个反应具有极高的特异性（主要针对G-细菌内毒素）和灵敏度（可检测到0.001-0.1 Endotoxin Units, EU/mL）。
  • 反应结果： 根据检测方法的不同，反应的终点可以是凝胶形成（凝胶法）、浊度变化（浊度法）或颜色变化（显色基质法）。

三、 主要检测方法

根据观察反应终点信号的不同，细菌内毒素检测主要有以下几种标准方法：

  1. 凝胶限度法（Gel-Clot Limit Test）：

    • 原理： 将规定浓度的鲎试剂与一定体积的供试品溶液（或稀释液）混合，在适宜的温度（通常37±1°C）下孵育一定时间（通常60±2分钟）。
    • 结果判断： 肉眼观察管内混合物是否形成坚实凝胶。形成坚实凝胶并能在倾斜180°时保持不变形，判为阳性（+），表示内毒素含量≥规定限值；未形成凝胶或形成不坚实凝胶（倾斜即变形流动），判为阴性（-），表示内毒素含量<规定限值。
    • 特点： 方法简单、经济、直观，无需特殊仪器，是历史最悠久、应用最广泛的方法。灵敏度取决于所使用的鲎试剂规格（通常表示为λ, 如0.03 EU/mL, 0.06 EU/mL, 0.125 EU/mL, 0.25 EU/mL）。

  2. 光度测定法：

    • 浊度法（Turbidimetric Test）：
      • 终点浊度法： 与凝胶法类似，但在孵育终点时间点测量反应混合物的浊度变化（通过特定波长吸光度增加判断）。浊度增加超过阴性对照或达到设定阈值判为阳性。
      • 动态浊度法： 在反应孵育过程中，连续或间断监测反应混合物浊度（吸光度）随时间的变化。通过对反应曲线进行分析（如达到特定吸光度所需时间或反应速率），并参照内毒素浓度标准曲线计算出供试品中内毒素的定量结果。
    • 显色基质法（Chromogenic Test）：
      • 终点显色法： 利用人工合成的显色底物（通常为多肽偶联的对硝基苯胺，pNA）取代天然凝固蛋白原。内毒素激活的凝固酶（原）能水解底物释放出黄色的游离pNA。在孵育终点加入终止液（如醋酸）后，测量特定波长下的吸光度。吸光度高于阴性对照或标准阈值判为阳性。
      • 动态显色法： 在反应孵育过程中，连续或间断监测显色产物pNA释放导致的吸光度增加速率。通过对反应曲线进行分析，并参照内毒素浓度标准曲线计算出供试品中内毒素的定量结果。
    • 特点： 光度法（特别是动态法）能提供定量结果，灵敏度高，自动化程度高，客观性强，适用于大批量样品检测和过程监控。需要相应的分光光度计或专用微生物检测设备。

四、 关键步骤与质量控制

为确保细菌内毒素检测结果的准确性、可靠性和可比性，必须严格遵守药典（如《中华人民共和国药典》、《美国药典 USP》、欧洲药典 EP、日本药典 JP）的相关规定，并实施严格的质量控制：

  1. 鲎试剂灵敏度复核（Lysate Sensitivity Confirmation）： 使用国家或国际标准内毒素（如USP Reference Standard Endotoxin, RSE或CSE）测定每一批鲎试剂的实际灵敏度应在标示灵敏度（λ）的0.5λ至2λ范围内。

  2. 供试品干扰试验（Validation of Test for Interfering Factors）：

    • 目的： 确认在供试品存在下，所用的检测方法（包括鲎试剂种类、浓度和稀释倍数）是否能够准确检出添加的标准内毒素。
    • 方法： 将供试品溶液（或其最高浓度的无干扰稀释液）分别加入标准内毒素溶液（使其浓度达到2λ）和不含内毒素的水中，制备成“供试品阳性溶液（PPS）”和“供试品溶液（PS）”。同时用水制备“阳性产品对照组（PPC=2λ）”和“阴性产品对照组（NPC=水）”。
    • 判断标准：
      • 凝胶法： PPS和PPC均应呈阳性，PS和NPC均应呈阴性。
      • 光度法： PPS和PPC的回收率应在50%至200%之间（或符合药典特定要求），且PS和NPC的内毒素含量应小于所用方法的最低检测限。
    • 干扰处理： 若存在干扰（如抑制或增强），需通过稀释、过滤、调节pH、加入螯合剂（如Mg²⁺）、加热处理（仅适用于对热稳定的样品） 或更换更灵敏或抗干扰能力更强的鲎试剂类型（如重组C因子法）等方法消除干扰，直至通过干扰试验。稀释是最常用且有效的方法，但需确保稀释后样品的内毒素浓度乘以稀释倍数后仍低于规定的限值。

  3. 标准曲线的可靠性：

    • 光度法： 每次试验需建立内毒素标准曲线（通常包含至少3个浓度点，覆盖检测范围）。曲线的相关系数（r）必须≥0.980（或符合药典要求）。

  4. 阴性与阳性对照： 每次试验必须同时设立：

    • 阴性对照（Negative Control, NC）： 使用细菌内毒素检查用水（BET Water）代替供试品，用于确认试验环境、试剂和器具无内毒素污染。
    • 阳性对照（Positive Control, PC）： 用水或已知无干扰的溶液配制浓度为2λ的标准内毒素溶液，用于确认鲎试剂的反应活性。
    • 供试品阳性对照（PPS）： 见干扰试验部分，用于确认在供试品存在下能检出内毒素。

  5. 环境与器具： 整个试验过程需在严格控制的洁净环境下进行（最好在超净工作台或隔离器中），所有接触样品的玻璃器皿、塑料耗材等必须经过彻底的去热原处理（通常为250℃干烤≥30分钟或专用去热原程序）。

五、 应用场景

  1. 药品： 注射用水、注射剂（大输液、小针剂）、放射性药品、疫苗、血液制品、某些眼用制剂等的放行检验。
  2. 医疗器械： 植入物、体外循环管路、透析器、注射器等与血液或体液长期或短期接触器械的清洗液、浸提液检测。
  3. 生物制品原料与过程控制： 细胞培养基、添加剂、纯化过程中的中间体、缓冲液等。
  4. 透析液与冲洗液： 血液透析液、腹膜透析液、手术冲洗液等。
  5. 制药用水系统监控： 纯化水、注射用水（WFI）的日常监测。

六、 发展趋势

  • 重组C因子法（Recombinant Factor C, rFC）： 利用基因工程表达纯化的鲎凝血级联反应中的关键因子——C因子作为检测试剂。优点是完全避免了对天然鲎资源的依赖，可持续性好；特异性高（仅针对内毒素）；批次间一致性可能更好；某些情况下抗干扰能力更强。该技术在欧美法规中有越来越多被接受的趋势（写入部分药典章节作为替代方法），但仍需更多验证和应用经验积累。
  • 自动化与高通量： 基于光度法（尤其是动态法）的自动化检测系统不断发展，提高检测效率、减少人为误差。
  • 快速检测技术： 研究开发更快速的现场或在线检测方法。

结论

细菌内毒素检测是保障药品、医疗器械等产品安全性的生命线。基于鲎试剂（LAL）的凝胶法和光度法是目前应用最广泛、技术最成熟的标准方法。严格遵守药典规定，进行充分的干扰试验和严格的质量控制（包括鲎试剂复核、标准曲线、阴/阳性对照等），是获得准确、可靠检测结果的关键。随着科技进步，重组C因子法等新技术展现出良好的应用前景。无论是采用传统方法还是新技术，其核心目标始终是有效控制产品中的内毒素污染风险，最终保障患者的用药安全。