细胞数量及细胞存活率鉴别

细胞数量及细胞存活率鉴别：原理、方法与应用

在细胞生物学、生物医学研究、药物开发及组织工程等领域，准确测定细胞数量和评估细胞存活率是至关重要的基础环节。它们是判断实验体系状态、评估处理效应（如药物毒性、基因操作、环境刺激）、以及确保下游实验结果可靠性的关键指标。本文将系统介绍这两项参数的鉴别原理、常用方法及其应用要点。

一、 核心概念

1. 细胞数量： 指在给定样本（如培养皿、离心管、组织匀浆液）中存在的细胞总数。通常以单位体积内的细胞数（如细胞数/mL）或单位培养面积内的细胞数（如细胞数/cm²）表示。
2. 细胞存活率： 指在特定细胞群体中，具有完整细胞膜、保持基本代谢活性、具有增殖潜力或对刺激有反应能力的活细胞所占的百分比。它反映了细胞群体的健康状况。

二、 为什么需要同时鉴别细胞数量和存活率？

• 数量反映规模： 了解细胞总数是进行标准化操作的基础，例如接种相同数量的细胞进行平行实验、计算药物浓度（如IC50）、制备细胞悬液用于流式或移植等。
• 存活率反映质量： 仅知道细胞总数是不够的。一次处理可能杀死部分细胞，剩下的细胞数量虽然可观，但如果大部分细胞濒死或功能受损，实验结果（如基因表达分析、药物响应）将严重失真。高存活率是确保实验数据可靠性和可重复性的前提。
• 综合判断： 结合两者才能全面评估实验干预的效果（如：药物处理后细胞总数减少50%，存活率降至60%，说明不仅细胞被杀灭，存活的细胞也部分受损）。

三、 常用鉴别方法

细胞数量和存活率的测定通常基于细胞膜完整性、代谢活性或酶活性等差异。

(一) 基于细胞膜完整性的方法 - 染料排斥法

• 原理： 活细胞的细胞膜完整，能阻止某些染料进入；死细胞或膜严重受损的细胞，染料可自由进入并着色。
• 代表方法： 台盼蓝染色法
  • 原理： 台盼蓝是一种大分子蓝色阴离子染料，不能穿透活细胞的完整细胞膜。死细胞或膜受损细胞被染成蓝色。
  • 操作：
    1. 制备单细胞悬液。
    2. 将细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液按一定比例（如1:1或4:1）混合，轻柔混匀。
    3. 室温孵育约3分钟（避免时间过长导致活细胞也被染色）。
    4. 立即将混合液滴加至血球计数板（或自动细胞计数仪的载样槽）。
    5. 计数：
       • 手动计数（血球计数板）： 在显微镜下观察计数板中央大方格内的四个角落大方格（或特定区域）。分别计数无色透明的活细胞和染成蓝色的死细胞。
       • 自动计数仪： 仪器基于图像识别或电阻抗原理自动区分并计数活细胞和死细胞。
  • 计算：
    • 细胞浓度 (cells/mL) = (计数的细胞总数 / 计数的区域体积) * 稀释倍数 * 10⁴ (对于标准血球计数板)
    • 细胞存活率 (%) = (活细胞数 / (活细胞数 + 死细胞数)) * 100%
  • 优点： 快速、简便、经济、结果直观。是实验室最常用的金标准方法之一。
  • 局限性：
    • 只能区分膜完整与膜破损细胞，无法判断膜完整但代谢停滞的细胞（如早期凋亡细胞）。
    • 对细胞聚团敏感，聚团细胞中心即使死亡也可能不被染色。
    • 染色时间需严格控制。
    • 需要形成单细胞悬液，对组织样本需充分解离。
• 其他染料： 伊红Y、苯胺黑等，原理类似。

(二) 基于代谢活性的方法

• 原理： 利用活细胞特有的代谢能力将无色的底物转化为有色、荧光或发光的产物。
• 代表方法：
  • MTT/XTT/WST-1 法：
    • 原理： 活细胞线粒体脱氢酶能将水溶性四唑盐（如MTT、XTT、WST-1）还原成不溶于水的紫色甲臜结晶（MTT）或水溶性的橙色甲臜产物（XTT/WST-1）。产物量（通过吸光度OD值测定）与活细胞数量成正比。
    • 操作： 细胞接种于微孔板，处理后加入四唑盐溶液孵育数小时，加入溶解液（MTT法）或直接读取（XTT/WST-1法）特定波长下的吸光度。
    • 优点： 适用于高通量筛选（微孔板），反映细胞代谢活力。
    • 局限性： 主要反映代谢活性，不直接等同于细胞数量或膜完整性；受细胞类型、增殖状态、处理因素（如影响线粒体功能的药物）影响；需要标准曲线推算细胞数；对贴壁细胞更适用。
  • 荧光素二乙酸酯 (FDA) / 碘化丙啶 (PI) 双染法：
    • 原理： FDA本身无荧光，可自由进入细胞，被活细胞内的酯酶水解生成绿色荧光的荧光素，累积在活细胞内。PI不能穿透活细胞膜，但能进入死细胞与DNA结合发出红色荧光。流式细胞仪或荧光显微镜下可区分活细胞（绿）、死细胞（红）和濒死细胞（绿红双染）。
    • 优点： 比台盼蓝更灵敏，可检测早期膜损伤细胞；适用于流式分析，可结合其他参数。
    • 局限性： 需要荧光检测设备；FDA稳定性较差，需现配现用；荧光信号随时间衰减。

(三) 其他方法

• 流式细胞术： 除FDA/PI外，还可利用膜联蛋白V（Annexin V）结合磷脂酰丝氨酸（PS）外翻（凋亡早期）与PI区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。是最强大、信息量最丰富的方法，但需要昂贵仪器和专业操作。
• 克隆形成实验： 评价单个细胞增殖潜能的“金标准”，间接反映长期存活率，但耗时长（1-3周）。
• ATP检测： 活细胞含有ATP，其含量与活细胞数成正比。利用荧光素酶-荧光素体系检测发光值。快速、灵敏，适合高通量，但试剂昂贵。

四、 方法选择与结果解读要点

1. 明确实验目的：
   • 需要快速粗略估计？ → 台盼蓝染色+血球计数板。
   • 需要高通量筛选？ → MTT/XTT/WST-1 或 ATP检测。
   • 需要区分凋亡/坏死？ → 流式细胞术（Annexin V/PI）。
   • 需要评估长期增殖潜力？ → 克隆形成实验。
2. 考虑细胞类型与状态：
   • 原代细胞、悬浮细胞、组织样本 → 首选台盼蓝（需充分解离）或流式细胞术。
   • 贴壁细胞 → 可选择MTT等，但需注意解离对结果的影响。
   • 处理因素是否影响线粒体功能或膜特性？ → 选择互补方法验证（如台盼蓝+MTT）。
3. 标准化操作：
   • 取样代表性： 确保细胞悬液混合均匀。
   • 染色条件： 染料浓度、孵育时间、温度严格一致。
   • 计数规范： 对于血球计数板，遵循计数区域规则，至少计数200个细胞以减小统计误差。熟练操作以减少人为偏差。
   • 仪器校准： 自动计数仪或流式细胞仪需定期校准。
   • 设置对照： 包括已知活性的阳性对照（如未处理健康细胞）和阴性对照（如加热杀死的细胞）。
4. 结果解读：
   • 存活率阈值： 通常认为>90%是理想的健康状态，>80%是可接受的，低于70%可能对许多实验产生显著影响。但具体阈值需根据实验要求确定。
   • 结合细胞形态： 显微镜观察细胞形态（皱缩、碎片、空泡等）是评估细胞状态的重要补充。
   • 考虑背景因素： 培养基成分、血清批次、支原体污染、操作不当（如胰酶消化过度、冻存复苏损伤）都会影响结果。

五、 质量控制与优化建议

• 定期维护仪器： 保证血球计数板洁净干燥，自动计数仪镜头清洁，流式细胞仪性能稳定。
• 试剂质量控制： 使用新鲜配制的染料溶液（如台盼蓝、FDA），避免反复冻融。
• 人员培训： 确保实验人员熟练掌握操作流程和计数规范。
• 方法验证： 对新方法或关键实验，使用已知活性的标准样本验证方法的准确性。
• 环境控制： 操作时避免极端温度变化，细胞悬液和染料保持室温。

结论：

准确鉴别细胞数量和存活率是细胞实验成功的基石。台盼蓝染色法凭借其简便、快速和经济的特点，成为最广泛应用的基础方法。然而，研究者应根据具体的实验需求、细胞类型和研究目的，选择最合适的方法或组合多种方法进行验证。严谨的实验设计、标准化的操作流程以及对结果的合理解读，是获得可靠数据、得出科学结论的关键保障。始终牢记，高质量的细胞样本是生命科学研究可重复性和有效性的前提。