VEGF 结合分析（ELISA）

发布时间：2025-06-21 13:55:55 阅读量：3 作者：生物检测中心

VEGF结合分析（ELISA）：原理、应用与操作指南

血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF） 是调控血管生成（Angiogenesis）和血管通透性的核心因子。它在胚胎发育、创伤愈合、肿瘤生长与转移、以及多种病理状态（如糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎）中扮演关键角色。因此，准确、灵敏地检测和定量样本（如血清、血浆、细胞培养上清液、组织匀浆液）中的VEGF蛋白浓度或结合活性，对于基础研究和临床诊断至关重要。酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA），特别是VEGF结合分析（或称VEGF结合ELISA），因其高特异性、灵敏度、高通量及相对简便的操作，成为最广泛应用的检测方法之一。以下将详细介绍其原理、操作步骤、结果分析及临床应用价值。

一、 VEGF结合分析（ELISA）的核心原理

VEGF结合分析本质上是一种夹心法ELISA（Sandwich ELISA），专门设计用于检测VEGF与其特定受体（如VEGFR1/Flt-1, VEGFR2/KDR/Flk-1）或结合蛋白（如Neuropilin, VEGF Trap类药物）的结合能力或亲和力。其核心原理基于“双抗体夹心”结构，但其中一个捕获/检测元件替换为受体或结合蛋白：

  1. 包被（Coating）： 将高亲和力、高特异性的VEGF捕获抗体或可溶性VEGF受体/结合蛋白（如sVEGFR1, sVEGFR2） 固定在微孔板（通常是96孔板）的孔底表面。这一步通常需要过夜孵育。
  2. 封闭（Blocking）： 加入非反应性蛋白溶液（如牛血清白蛋白BSA或酪蛋白）覆盖孔内未被抗体/受体占据的表面位点，防止后续步骤中非特异性结合，减少背景信号。
  3. 加样与结合（Sample Addition and Binding）： 加入待测样本（含VEGF蛋白）或已知浓度的标准品（重组人VEGF蛋白梯度稀释液）。样本中的VEGF会与包被在孔底的捕获抗体或受体/结合蛋白特异性结合。孵育一段时间后，洗去未结合的成分。
  4. 检测（Detection）：
    • 方法A（检测VEGF结合能力）： 加入生物素（Biotin）标记的VEGF。如果样本中的VEGF已经饱和了包被的受体/结合蛋白位点，则生物素-VEGF的结合会减少。反之，如果样本中VEGF少，则生物素-VEGF结合多。洗板后，加入链霉亲和素（Streptavidin）标记的辣根过氧化物酶（HRP）。链霉亲和素与生物素发生高亲和力结合。
    • 方法B（检测VEGF浓度）： 加入生物素标记的检测抗体（该抗体识别VEGF上不同于捕获抗体或受体的另一个表位）。洗板后，同样加入链霉亲和素-HRP。
  5. 信号产生（Signal Generation）： 加入HRP的无色底物（如TMB）。HRP催化底物发生显色反应，生成蓝色产物。
  6. 终止反应与读数（Stopping and Reading）： 加入终止液（如硫酸）使反应停止，蓝色变为黄色。使用酶标仪在特定波长（如450nm，TMB终止后）测量每个孔的光密度（OD值）。

二、 关键实验步骤详解

  1. 试剂准备：
    • 根据说明书或实验方案准备所有试剂（包被缓冲液、封闭液、洗涤缓冲液、标准品、样本、检测抗体/生物素-VEGF、酶结合物、底物溶液、终止液）。
    • 将冻干标准品或高浓度储备液用稀释液（通常是含蛋白的缓冲液）精确梯度稀释，建立标准曲线（例如：1000 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL, 125 pg/mL, 62.5 pg/mL, 31.25 pg/mL, 15.625 pg/mL, 0 pg/mL）。
    • 样本处理：血清/血浆需按标准方法分离；细胞上清液需离心去除细胞碎片；组织样本需匀浆、离心取上清。样本可能需要适当稀释（用稀释液）以使其浓度落在标准曲线范围内。
  2. 包被： 用包被缓冲液稀释捕获抗体或可溶性受体/结合蛋白至工作浓度。将稀释液加入微孔板各孔（通常100μL/孔），封板膜封板，4℃孵育过夜（12-16小时）。
  3. 洗涤： 弃去孔内液体。每孔加入洗涤缓冲液（如300μL），浸泡30秒至1分钟后弃去。重复3-5次。最后一次洗完后在吸水纸上拍干。
  4. 封闭： 每孔加入封闭液（如200μL），室温孵育1-2小时（或按说明书操作）。
  5. 洗涤： 同步骤3。
  6. 加样与孵育： 每孔加入标准品、稀释好的样本（通常100μL/孔），设置空白孔（只加稀释液）。封板，室温或37℃孵育1-2小时（或按说明书操作）。
  7. 洗涤： 同步骤3。
  8. 加检测试剂与孵育：
    • 方法A：加入适当稀释的生物素标记的VEGF（100μL/孔），孵育（如室温1小时）。
    • 方法B：加入生物素标记的检测抗体（100μL/孔），孵育（如室温1小时）。
  9. 洗涤： 同步骤3。
  10. 加酶结合物与孵育： 每孔加入适当稀释的链霉亲和素-HRP（100μL/孔）。封板，室温避光孵育30分钟至1小时。
  11. 洗涤： 同步骤3，但洗涤次数可能需要增加（如5-7次），确保彻底去除未结合的酶。
  12. 加底物与显色： 每孔加入底物溶液（如TMB，100μL/孔）。室温避光孵育15-30分钟（或观察到足够颜色变化）。
  13. 终止反应： 每孔加入终止液（如2M H₂SO₄, 50-100μL/孔）。轻轻混匀。
  14. 读数： 立即在酶标仪上读取450nm（主波长）的OD值。如果使用双波长读数，可设置570nm或630nm作为参考波长扣除孔板本身的光学不均一性。

三、 结果分析与计算

  1. 数据处理： 计算每个标准品孔和样本孔的平均OD值（减去空白孔OD值）。
  2. 绘制标准曲线： 以标准品浓度的对数值（X轴）对应其平均OD值（Y轴），绘制标准曲线。通常使用四参数逻辑（4-PL）或对数-线性回归进行拟合，以获得最佳曲线。
  3. 样本浓度计算： 将样本的平均OD值代入标准曲线方程，计算出对应的浓度值。注意： 如果样本经过稀释，计算出的浓度需乘以相应的稀释倍数。
  4. 结合分析解读（方法A）： 样本孔的OD值越低，表示样本中存在的VEGF越多（因为其竞争结合了包被受体，导致生物素-VEGF结合减少）。因此，OD值与样本VEGF浓度呈负相关。通常需要将结果与不加竞争样本（仅含生物素-VEGF）的对照孔OD值进行比较，计算结合抑制率等参数。

四、 VEGF结合分析（ELISA）的重要应用领域

  1. 肿瘤研究与诊断：
    • 肿瘤标志物： 监测血清/血浆VEGF水平，评估肿瘤负荷、侵袭性、血管生成活性及患者预后。
    • 抗血管生成治疗疗效监测： 评估靶向VEGF/VEGFR通路药物（如贝伐珠单抗、阿柏西普、雷莫芦单抗等）的治疗效果和耐药性。
    • 机制研究： 研究肿瘤细胞分泌VEGF的调控机制及其与肿瘤微环境相互作用的分子基础。
  2. 心血管疾病：
    • 心肌缺血与血管新生： 研究缺血心肌组织或循环中VEGF水平变化，评估侧支循环形成潜力。
    • 动脉粥样硬化： 研究VEGF在斑块不稳定性和血管通透性中的作用。
  3. 眼科疾病：
    • 年龄相关性黄斑变性（AMD）： 玻璃体内注射抗VEGF药物（如雷珠单抗、阿柏西普）是主要治疗手段。研究房水或血清中VEGF水平变化与疾病活动度和治疗反应相关。
    • 糖尿病视网膜病变： VEGF是导致病理性新生血管和视网膜水肿的关键因子，检测其水平有助于评估病情。
  4. 炎症与自身免疫性疾病：
    • 类风湿性关节炎（RA）： 滑膜组织和滑液中VEGF水平升高，与关节炎症、血管翳形成和骨质破坏相关。
    • 银屑病： 皮损处VEGF高表达，促进病理性血管生成。
  5. 药物研发与筛选：
    • 结合活性/亲和力测定： 评估候选药物（如抗体、小分子抑制剂、VEGF Trap类融合蛋白）与VEGF或其受体的结合能力和特异性（方法A的核心应用）。
    • 药效学生物标志物： 在临床前和临床研究中，检测VEGF水平变化作为药物靶点抑制的指标。
  6. 基础生物学研究： 研究VEGF基因表达调控、不同亚型（如VEGF-A₁₂₁, VEGF-A₁₆₅, VEGF-A₁₈₉）的功能差异、信号通路激活机制等。

五、 实验注意事项与局限性

  1. 样本处理： 血清/血浆分离需及时规范，避免溶血、反复冻融。细胞上清液收集时间点要一致。组织样本处理要迅速，防止蛋白降解。
  2. 标准曲线： 必须包含足够多的浓度点（≥7点），覆盖预期样本浓度范围。每次实验都应重新制备标准曲线。
  3. 板间/板内差异： 加样需准确、迅速。设置复孔（建议至少双复孔）以评估重复性。
  4. 洗涤： 充分且一致的洗涤是降低背景、提高信噪比的关键。确保每次洗涤液量足够，浸泡时间一致。
  5. 孵育时间与温度： 严格遵守推荐的时间和温度，否则会影响结合效率和特异性。
  6. 干扰物质： 某些样本（如溶血血清、高脂血、含RF或HAMA的样本）可能产生干扰。需通过稀释或特殊处理消除。
  7. VEGF亚型与复合物： 不同ELISA试剂可能检测不同VEGF亚型或结合状态（游离态或与可溶性受体结合态）。需明确所用试剂检测的范围。
  8. 灵敏度与动态范围： ELISA的灵敏度（通常pg/mL级别）和动态范围有限，极高或极低浓度样本可能需要稀释或浓缩。
  9. 绝对定量： ELISA测量的是免疫反应性，而非绝对生物活性。结果需谨慎解读，尤其是比较不同来源样本时。
  10. 替代方法： 对于更精确的结合动力学（如Kon, Koff, KD），需使用表面等离子共振（SPR）或生物膜层干涉技术（BLI）。细胞功能实验（如内皮细胞增殖/迁移/小管形成）能反映VEGF的生物活性。

总结

VEGF结合分析（ELISA）是研究血管生成核心因子VEGF的强大工具。其基于夹心法的原理（特别是利用受体/结合蛋白检测结合能力）提供了高度特异和灵敏的检测手段。通过标准化的操作流程和严谨的数据分析，该方法在基础研究、药物开发及多种疾病的临床诊断与监测中发挥着不可替代的作用。理解其原理、熟练掌握操作技巧并认识其局限性，对于获得可靠、可重复的结果至关重要。随着技术的进步，更灵敏、更快速、多重检测的ELISA平台也在不断发展，将进一步拓展VEGF检测在生物医学领域的应用深度和广度。