二级结构和三级结构（远近紫外 CD）

发布时间：2025-06-21 13:35:00 阅读量：5 作者：生物检测中心

蛋白质结构的指纹：二级、三级结构及其圆二色谱解析

蛋白质是生命活动的核心执行者，其复杂多样的生物学功能直接取决于其精确的三维空间结构。深入理解蛋白质结构对于揭示生命机制、开发新型药物和生物技术至关重要。在诸多结构解析技术中，圆二色谱（CD）以其快速、灵敏、对溶液状态无损以及能提供不同层次结构信息的独特优势，成为不可或缺的工具。本文将系统阐述蛋白质二级结构与三级结构的概念，并重点解析如何利用远紫外和近紫外CD光谱对其进行表征。

一、 构筑基石：蛋白质二级结构

  • 定义： 二级结构是指蛋白质多肽链局部片段通过氢键网络维持的规则、重复的空间构象。它是构成蛋白质三维折叠的基础模块。
  • 主要类型与特征：
    • α-螺旋： 多肽链主链骨架围绕中心轴盘旋形成的右手螺旋结构。相邻螺圈之间通过羰基氧（C=O）与氨基氢（N-H）形成稳定的链内氢键（i → i+4）。每个氨基酸残基沿轴向平移约1.5Å，螺旋旋转约100°。具有高度刚性和各向异性。
    • β-折叠： 由几乎完全伸展的多肽链段（β-链）通过链间氢键平行或反平行排列形成的片层结构。氢键连接相邻β-链上的羰基氧和氨基氢。反平行折叠通常更稳定。折叠片可扭曲形成桶状或曲面。
    • β-转角： 连接多肽链不同片段（如连接相邻反平行β-链）的紧凑回折结构，通常涉及4个连续的氨基酸残基。通过第1位残基的羰基氧与第4位残基的氨基氢形成氢键稳定结构。Gly和Pro常出现于此。
    • 无规卷曲： 指蛋白质中不归属于上述特定规则构象的、相对柔性的肽链片段。虽名为“无规”，但其构象在特定蛋白质中是确定且具有功能的。它连接不同的规则二级结构元件，对蛋白质的柔性和功能位点形成至关重要。

二、 空间折叠：蛋白质三级结构

  • 定义： 三级结构是指整条多肽链在二级结构基础上，通过进一步的折叠、盘绕，形成具有特定三维空间排布的紧密球状或纤维状结构。它包含了蛋白质中所有原子的空间坐标。
  • 维系作用力： 三级结构的稳定主要依靠氨基酸侧链间的多种相互作用：
    • 疏水相互作用： 非极性疏水侧链为避开水环境而聚集在分子内部形成疏水核心，是驱动折叠和维持结构稳定的最主要动力。
    • 氢键： 存在于带电荷的极性侧链之间、极性侧链与主链、极性侧链与水分子之间。
    • 范德华力： 原子间普遍存在的瞬时偶极吸引力，在原子紧密堆积时贡献显著。
    • 离子键（盐桥）： 带相反电荷的侧链（如Asp/Glu的羧基与Lys/Arg的氨基）之间的静电吸引力。
    • 二硫键： 特定位置的两个半胱氨酸残基侧链氧化形成的共价键（-S-S-），对稳定某些胞外蛋白质（如抗体）的结构尤为重要。

三、 结构探测利器：圆二色谱（CD）原理

圆二色谱测量的是手性物质（如蛋白质）对左旋圆偏振光（L-CPL）和右旋圆偏振光（R-CPL）吸收的差值（ΔA = A_L - A_R）随波长的变化。蛋白质分子中的生色团（主要是肽键和芳香族氨基酸侧链）处于不对称（手性）环境中时，对两种CPL的吸收不同，产生Cotton效应（即CD谱上的正峰或负峰）。峰的位置、强度和形状直接反映了生色团所处局部环境的立体化学特征（如构象、对称性改变、溶剂暴露程度等）。

四、 远紫外CD：解析蛋白质二级结构的核心窗口

  • 波长范围： 通常指 190 - 250 nm 区域。
  • 信号来源： 此区域的CD信号主要来源于蛋白质主链肽键（酰胺基团） 的n→π和π→π电子跃迁。不同二级结构中肽键的排列方式、氢键模式及其所处的手性环境不同，导致其特征性的CD谱图。
  • 特征光谱与结构对应：
    • α-螺旋： 在 222 nm 附近呈现明显的负峰（n→π跃迁），在 208 nm 附近呈现更强的负峰（π→π跃迁），在 190 - 195 nm 附近呈现一个强的正峰。这是α-螺旋最典型的指纹图谱。
    • β-折叠： 在 215 - 218 nm 附近呈现一个负峰（强度通常弱于α-螺旋在208/222nm的峰），而在 195 - 200 nm 附近呈现一个较强的正峰。平行与反平行β-折叠的CD谱略有差异。
    • β-转角： 通常在 ~206 nm 附近呈现一个负峰，在 ~180 nm 附近呈现一个正峰（远紫外区不易测量）。不同类型转角的CD特征存在差异。
    • 无规卷曲： 通常在 ~198 nm 附近呈现一个强的负峰，在 ~220 nm 附近呈现一个弱的正峰或接近零。
  • 应用：
    • 二级结构含量估算： 通过将实验测得的CD谱图与已知结构的参考蛋白质数据库（或设定好的二级结构基集）进行拟合（如CONTIN、CDSSTR、SELCON等算法），可以定量计算样品中各种二级结构类型（α-螺旋、β-折叠、转角、无规卷曲）的相对含量百分比。
    • 构象变化监测： 当蛋白质所处环境改变（如pH、温度、变性剂浓度变化）或与其他分子相互作用时，其二级结构会发生变化。通过追踪远紫外CD谱图（特别是222nm、208nm、195nm等关键波长处的强度或峰形变化），可以灵敏地探测这种构象转变（如折叠/去折叠、α-螺旋含量增减、聚集等）。
    • 结构稳定性研究： 结合变温CD（热变性）或化学变性CD（尿素/盐酸胍滴定），通过测量特征波长（如222nm）的CD值随温度或变性剂浓度的变化，可以绘制变性曲线，获得重要的热力学参数（如熔点Tm、折叠自由能ΔG°等），评估蛋白质的（去）折叠平衡和稳定性。

表：蛋白质主要二级结构在远紫外区的特征CD谱

注：180 nm附近的信号在标准远紫外CD仪器中通常难以测量。

五、 近紫外CD：洞察蛋白质三级结构和精细包装

  • 波长范围： 通常指 250 - 320 nm 区域。
  • 信号来源： 此区域的CD信号主要来源于蛋白质中芳香族氨基酸侧链（苯丙氨酸Phe、酪氨酸Tyr、色氨酸Trp）以及二硫键（-S-S-）的电子跃迁。这些生色团的光学活性（产生CD信号）强烈依赖于其精确的三维空间位置、微环境（极性、氢键、邻近带电基团）以及它们之间的相互作用（偶极耦合）。因此，近紫外CD对蛋白质的三级结构、侧链构象和包装状态极其敏感。
  • 特征光谱与生色团对应：
    • 色氨酸 (Trp)： 信号通常在 290 - 305 nm 区域，具有精细结构。峰的位置和强度对Trp残基的埋藏深度、局部环境极性（如溶剂暴露程度）以及邻近带电基团极其敏感。是探测局部构象变化最灵敏的探针之一。
    • 酪氨酸 (Tyr)： 信号主要在 275 - 285 nm 区域，常呈现峰肩或双峰特征。其CD信号受酚羟基是否参与氢键以及环境极性的显著影响。
    • 苯丙氨酸 (Phe)： 信号在 255 - 270 nm 区域，通常呈现一系列尖锐的精细结构峰（常称为“指纹区”）。这些峰主要反映Phe残基自身的绝对构型及其所处的手性环境，对全局构象变化相对敏感度较低。
    • 二硫键 (-S-S-)： 在 250 - 280 nm 区域有较宽弱的负CD信号。信号强度取决于二硫键的手性构象（左手或右手螺旋）及其键角张力。
  • 应用：
    • 三级结构完整性验证： 天然态（正确折叠）的蛋白质具有独特且特征性的近紫外CD谱图，反映了其精确的三维包装。通过与标准品（如天然纯品）或文献报道的谱图比较，可以判断重组蛋白、纯化样品是否保持了正确的三级结构。
    • 探测精细构象变化： 对蛋白质三级结构的微小扰动（如点突变、配体结合（特别是涉及芳香残基的结合位点）、寡聚化状态改变、微环境变化等）往往会导致近紫外CD谱图发生显著变化（峰位移动、强度增减、峰形改变等），其灵敏度常高于远紫外CD。这种现象称为“指纹特征丢失”。
    • 研究蛋白质-配体相互作用： 当小分子配体结合到蛋白质的特定位点（尤其涉及或邻近芳香残基时），会改变这些残基的微环境或手性相互作用，从而引起近紫外CD信号的改变。滴定实验可用于研究结合常数和化学计量比。

六、 远近紫外CD的综合应用

将远紫外CD和近紫外CD分析相结合，能获取蛋白质从局部二级结构到整体三级包装的全面结构信息：

  1. 结构表征与验证： 新表达或纯化的蛋白质，可通过其远紫外CD谱评估二级结构含量是否符合预期（如与同源蛋白比较），同时通过近紫外CD谱验证其是否具有正确、紧密的三级包装（存在特征指纹）。
  2. 构象稳定性研究： 在热变性或化学变性过程中，远紫外CD（如222nm信号）监测二级结构解折叠，近紫外CD（如290nm附近Trp信号）监测三级结构的解离。两者结合可揭示折叠/去折叠的协同性或阶段性。
  3. 折叠动力学： 快速混合CD停流技术可实时监测蛋白质折叠/去折叠过程中远、近紫外CD信号随时间的变化，追踪不同层次结构形成的动力学路径和时间尺度。
  4. 分子互作研究： 研究蛋白质与配体（药物、底物、辅因子、核酸或其他蛋白质）结合时，远紫外CD可揭示结合是否诱导了二级结构改变（如诱导螺旋形成），近紫外CD则可灵敏探测结合位点的微环境变化或结合引起的三级结构微扰。
  5. 结构域分析： 对于多结构域蛋白质，不同结构域可能对整体CD信号有不同贡献。结合蛋白质工程（如结构域删除或截短突变体），CD光谱可用于研究单个结构域的结构特性及其在整体折叠中的作用。

七、 实验要点与注意事项

  1. 样品制备： 蛋白质样品需高纯度（避免杂质干扰），缓冲液应透明、尽量不含发色团（避免高浓度Tris、DTT、还原型谷胱甘肽等），离子强度适中。常用磷酸盐或硼酸盐缓冲液。
  2. 浓度与光程： 浓度需精确测定（紫外分光光度法）。远紫外测量浓度通常较高（0.1 - 0.5 mg/ml），使用短光程石英比色皿（0.1 mm 或 0.2 mm）；近紫外测量浓度可稍低（0.2 - 1.0 mg/ml），使用常规光程比色皿（1 mm 或 10 mm）。需确保吸光度在仪器线性范围内（通常A < 1.2）。
  3. 仪器校准： 需定期使用标准光学活性物质（如樟脑磺酸CSA）进行仪器波长和椭圆度校准。
  4. 数据采集： 设置合适的光谱范围、扫描速度、响应时间、带宽和累加次数，以获得高信噪比的光谱。溶剂背景谱必须采集并在样品谱中扣除。
  5. 数据分析： 二级结构定量分析需选择合适的算法和参考数据集。近紫外谱图的解析需要经验，关注特征峰（特别是Trp峰）的变化。结合其他结构生物学技术（如X射线晶体学、NMR、荧光光谱）进行验证和深入解读。

结论

蛋白质的二级结构和三级结构是其发挥复杂生物功能的物质基础。圆二色谱技术，特别是远紫外CD和近紫外CD的联合应用，为在溶液状态下快速、无损地表征蛋白质的这两个关键结构层次提供了强有力的手段。远紫外CD如同捕捉蛋白质主链“骨架”形态的镜头，清晰揭示α-螺旋、β-折叠等核心构象单元的组成与变化；而近紫外CD则如同洞察侧链“细节”的显微镜，灵敏反映色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸所处的微环境及整体三级包装的精细状态。通过解读CD光谱这本独特的“光学指纹”，研究者能够深入理解蛋白质的折叠机制、稳定性、构象动态变化及其与配体的相互作用过程，为生命科学研究、生物制药开发和生物材料设计等领域提供不可或缺的结构信息支撑。

参考文献

  1. Greenfield, N. J. (2006). Using circular dichroism spectra to estimate protein secondary structure. Nature Protocols, 1(6), 2876-2890.
  2. Kelly, S. M., Jess, T. J., & Price, N. C. (2005). How to study proteins by circular dichroism. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics, 1751(2), 119-139.
  3. Woody, R. W. (1995). Circular dichroism. Methods in Enzymology, 246, 34-71.
  4. Johnson, W. C. (1999). Analyzing protein circular dichroism spectra for accurate secondary structures. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 35(3), 307-312.
  5. Morrisett, J. D. (2004). The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function. Current Protein and Peptide Science, 5(6), 501-512.
  6. Whitmore, L., & Wallace, B. A. (2004). DICHROWEB, an online server for protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopic data. Nucleic Acids Research, 32(Web Server issue), W668-W673.