糖型分析（HILIC-UPLC-FLD）

发布时间：2025-06-21 13:27:26 阅读量：4 作者：生物检测中心

糖型分析：基于HILIC-UPLC-FLD联用技术的精准解析与应用

摘要： 糖基化修饰是生物分子（尤其是蛋白质）最常见、最复杂的翻译后修饰之一。糖链结构（即糖型）的细微差异直接影响生物分子的结构稳定性、生物活性、免疫原性、药代动力学等关键性质。发展高灵敏度、高分辨率的糖型分析方法对于生物医药研发、疾病诊断标志物筛选、食品科学及基础生物学研究至关重要。本报告详细阐述了基于亲水作用色谱-超高效液相色谱-荧光检测（HILIC-UPLC-FLD）联用技术的糖型分析方法，涵盖其原理、关键步骤、优化策略、应用领域及挑战展望。

一、 糖型分析的重要性

糖型分析的核心目标是解析糖链的精细结构，包括：

  1. 单糖组成： 构成糖链的基本单元种类（如甘露糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、岩藻糖、唾液酸等）。
  2. 糖苷键连接方式： α/β构型，连接位置（1-2, 1-3, 1-4, 1-6等）。
  3. 分支结构： 糖链的分支程度和模式。
  4. 宏观不均一性： 糖基化位点是否被占据。
  5. 微观不均一性： 同一糖基化位点上连接的糖链结构的多样性。

糖型结构的复杂性使其分析极具挑战性，需要强大的分离与检测技术的协同。

二、 HILIC-UPLC-FLD联用技术原理

该技术体系整合了三种关键技术优势：

  1. 亲水作用色谱 (HILIC)：
    • 原理： 基于糖类化合物极强的亲水性，利用极性固定相（如酰胺基、二醇基、氨基键合硅胶）和含高比例有机相（通常为乙腈）的起始流动相进行分离。糖分子在固定相表面的水合层与流动相之间分配，保留行为主要由糖分子的极性、官能团数量和空间结构决定。
    • 优势： 对结构高度相似、亲水性强的糖链异构体（如不同连接方式的二糖、唾液酸异构体、分支差异等）具有出色的分离能力，是分离复杂糖混合物的理想选择。兼容高浓度有机相，有利于后续质谱检测链接。
  2. 超高效液相色谱 (UPLC)：
    • 原理： 采用小粒径（通常<2 μm）色谱柱填料，在超高系统压力下运行，显著提升色谱分离效率。
    • 优势：
      • 高分辨率： 显著提高峰容量，能分离更复杂的糖型混合物。
      • 高速度： 大幅缩短分析时间，提高通量。
      • 高灵敏度： 更窄的峰宽有助于提高检测灵敏度。
  3. 荧光检测 (FLD)：
    • 原理： 糖类本身通常缺乏紫外或荧光生色团。分析前需对游离寡糖的还原端进行荧光标记衍生化。标记后的糖分子在特定激发波长下发出荧光，FLD检测器进行高灵敏度检测。
    • 常用衍生化试剂： 2-氨基苯甲酰胺（2-AB）、2-氨基苯甲酸（2-AA）、2-氨基吡啶（2-AP）、邻氨基苯甲酸甲酯（Procainamide）等。选择时需考虑衍生效率、产物稳定性、荧光强度、质谱兼容性等因素。
    • 优势：
      • 高灵敏度： 远高于示差折光检测器（RID）和低波长紫外检测器。
      • 高选择性： 只检测标记成功的糖分子，有效降低背景干扰。
      • 通用性好： 适用于绝大多数还原性寡糖。

三、 HILIC-UPLC-FLD分析流程与关键步骤

  1. 样品前处理：
    • 糖蛋白释放： 对于糖蛋白样品，首先需通过酶解法（常用肽-N-糖苷酶F，PNGase F）或化学法（如肼解）将N-连接糖链完整释放出来。O-连接糖链释放通常更复杂（如β-消除结合还原胺化）。
    • 纯化富集： 释放的寡糖需通过固相萃取（如石墨化碳柱、亲水亲脂平衡柱）、沉淀法或离心超滤等方法去除蛋白质、盐分、酶和缓冲液等杂质，进行纯化和富集。
  2. 荧光标记衍生化：
    • 将纯化后的游离寡糖溶解在合适的反应溶剂中。
    • 加入荧光标记试剂（如2-AB）及其还原剂（如氰基硼氢化钠）。
    • 在优化的温度和时间（如65°C，2-4小时）下进行还原胺化反应，使荧光基团共价连接到寡糖的还原端。
    • 反应完成后，需通过沉淀、离心超滤或固相萃取等方法去除过量试剂和副产物。
  3. HILIC-UPLC分离：
    • 色谱柱： 选择适合寡糖分离的亲水性固定相，酰胺基柱最为常用。
    • 流动相：
      • A相： 高比例有机溶剂（如乙腈）。
      • B相： 挥发性缓冲盐水溶液（如甲酸铵或乙酸铵溶液），pH值通常调节至4.0-4.5以优化分离和质谱兼容性。
    • 梯度洗脱： 采用逐渐降低有机相比例（增加水相比例）的梯度程序，使寡糖按亲水性由弱到强依次洗脱（高甘露糖型通常先于复杂型洗脱）。梯度斜率需优化以实现最佳分离。
    • 柱温： 精确控制柱温（常在30-60°C范围）对重现性至关重要。
    • 进样量： 根据浓度和检测器灵敏度优化。
  4. 荧光检测 (FLD)：
    • 根据所用荧光标记试剂的激发和发射光谱特征设置FLD检测参数。
    • 典型参数 (例如标记物为2-AB)：
      • 激发波长 (Ex)： ~250 nm 或 ~330 nm（取决于具体仪器配置）。
      • 发射波长 (Em)： ~428 nm。
    • 优化光电倍增管增益，在避免饱和的前提下获得最佳信噪比。

四、 方法优化要点

  • 衍生化条件： 试剂浓度、比例、温度、时间、pH需优化以保证定量标记效率和产物稳定性，避免副反应。
  • 色谱柱选择与老化： 不同批次的亲水柱可能略有差异，新柱需充分平衡和老化（运行多次空白梯度）。
  • 梯度优化： 梯度斜率、起始和终止有机相比例对分辨率影响显著。复杂样品需精细调整梯度。
  • 缓冲液浓度与pH： 缓冲盐浓度影响保留时间和峰形，低浓度（如5-20 mM）常用。pH优化对分离唾液酸异构体和峰形很重要。
  • 柱温控制： 恒定的柱温是保留时间重现性的关键。
  • 系统适用性： 使用标准糖库或代表性样品定期评估系统性能（分辨率、保留时间、峰面积重现性）。

五、 应用领域

  1. 生物制药：
    • 治疗性抗体（单克隆抗体、融合蛋白）关键质量属性监控。
    • 生物仿制药糖型相似性精细比对研究。
    • 细胞培养工艺开发与优化（培养基、补料策略、培养参数对糖型影响）。
    • 稳定性研究中糖型变化的追踪。
    • 生物制品批放行与一致性评价。
  2. 疾病研究与诊断：
    • 发现和验证疾病（如癌症、炎症性疾病、遗传性糖基化缺陷病）相关的糖基化生物标志物。
    • 研究糖基化在疾病发生发展中的作用机制。
  3. 基础生物学研究：
    • 糖基转移酶/糖苷酶功能研究与底物特异性分析。
    • 糖基化在蛋白质折叠、运输、信号转导、细胞识别等过程中的作用研究。
    • 不同物种、组织、细胞类型糖型的比较分析。
  4. 食品科学：
    • 功能性低聚糖、乳制品中寡糖（如人乳寡糖HMOs）、蜂蜜等复杂糖类成分分析与质量控制。
    • 食品加工过程中糖类降解产物的分析。

六、 优势与挑战

  • 优势：
    • 高分辨率： HILIC结合UPLC，对糖型异构体分离能力卓越。
    • 高灵敏度： FLD提供极低的检测限（通常可达fmol-pmol级）。
    • 定量准确性高： 荧光标记通常具有良好的线性响应和重现性。
    • 结构选择性： HILIC分离模式对糖链细微结构差异敏感。
    • 兼容性好： 流出组分可直接引入质谱进行在线或离线结构确证（HILIC-UPLC-FLD-MS/MS）。
    • 相对高通量： UPLC缩短了运行时间。
  • 挑战与局限：
    • 衍生化步骤： 增加了样品处理的复杂性和时间，需要优化和控制以保证衍生效率一致；某些试剂存在毒性或稳定性问题。
    • 绝对结构鉴定： FLD仅提供保留时间和峰面积信息，无法直接提供糖链的绝对结构（如连接位点、异头构型）。需依赖保留时间与已知标准品的比对，或结合质谱、外切糖苷酶阵列分析进行确证。
    • 异构体共洗脱： 极其复杂的生物样本中，仍可能存在未能完全分离的异构体峰。
    • 标准品缺乏： 许多天然存在的复杂糖型结构缺乏商业化的纯品标准，限制了准确鉴定和绝对定量。
    • 方法开发周期： 优化色谱方法以适应不同样品的复杂性需要时间和经验。

七、 展望

HILIC-UPLC-FLD作为糖型分析的核心工具，其应用将持续深化：

  • 自动化集成： 样品前处理、衍生化、进样与分析流程的自动化将提高通量、减少人为误差。
  • 多重标记策略： 开发新型、更高效、更稳定的荧光或多通道标记试剂。
  • 更高分辨率分离： 新型HILIC固定相和更先进的UPLC系统（如1.x μm或亚微米填料）持续提升分离能力。
  • 与多维分离技术联用： 结合其他分离模式（如离子交换色谱）构建多维分离平台，应对极端复杂的糖型分析。
  • 智能化数据分析： 结合人工智能和机器学习算法，实现复杂糖型谱图的自动化解析、异构体识别和结构预测。
  • 标准物质库建设： 扩充糖链结构标准物质库对于方法标准化和结果互认至关重要。

结论

HILIC-UPLC-FLD联用技术凭借其对复杂糖型混合物卓越的分离能力和高灵敏度荧光检测，已成为糖组学研究和质量控制中不可或缺的强大工具。尤其在要求高分辨率、高通量和高灵敏度定量糖型分布的领域（如生物制药）发挥着核心作用。尽管面临衍生化操作复杂和绝对结构鉴定依赖辅助技术的挑战，随着方法标准化、自动化水平和多技术联用能力的不断提升，HILIC-UPLC-FLD将继续推动糖科学在生命健康、医学诊断和食品工业等多个前沿领域的深入发展和应用突破。

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