肝素效价检定

肝素是一种重要的抗凝血药物，广泛用于血栓栓塞性疾病的预防和治疗。由于肝素是从动物组织（如猪肠粘膜或牛肺）中提取的生物大分子多糖混合物，其分子结构和分子量具有不均一性，其生物活性（效价）与其化学含量并不直接等同。因此，对其生物效价进行准确检定至关重要，是评价肝素原料药及制剂质量、确保临床用药安全有效的核心环节。肝素效价检定是一种强制性的生物测定项目。

一、肝素效价检定的基本原理

肝素效价检定的核心在于评估其加速抗凝血酶III（ATIII）灭活特定凝血因子（主要是凝血因子IIa（凝血酶）和Xa）的能力，这是肝素发挥抗凝作用的主要机制。目前国际上普遍采用的方法主要基于测量肝素延长血液凝固时间的能力，主要分为两大类：

基于抗凝血酶III的体外测定法（生色底物法/光谱法）：
- 原理： 这是当前药典（如中国药典ChP、美国药典USP、欧洲药典EP）推荐的首选方法。该方法在体外模拟肝素的作用机制。肝素与ATIII结合，显著增强ATIII对活化凝血因子（如FXa或FIIa）的抑制作用。未被抑制的剩余活化凝血因子可以水解特定的人工合成生色底物（如对硝基苯胺连接的肽链），释放出黄色的对硝基苯胺（pNA）。通过分光光度计在特定波长（通常为405nm）下测定pNA的吸光度变化速率，该速率与剩余活化凝血因子的量成正比，进而与待测样品中肝素的浓度/效价成反比。
- 优点： 操作相对简便快速，精密度高，变异系数小，受动物个体差异影响小，易于标准化和自动化。
- 关键试剂： 活化凝血因子（FXa或FIIa）、抗凝血酶III（ATIII）、生色底物、缓冲液。
羊（或兔）血浆法：
- 原理： 这是一种经典的生物测定法。肝素加入含有钙离子的枸橼酸化羊血浆（或兔血浆）中，通过激活内源性凝血途径（接触激活）或外加凝血酶，启动凝血过程。肝素的存在显著延长该血浆的凝固时间。通过比较标准品和供试品在相同条件下延长血浆凝固时间的能力（通常在特定浓度范围内，凝固时间的对数与肝素浓度的对数呈线性关系），计算出供试品的效价。
- 方法： 常见的有全血凝固时间法、活化部分凝血活酶时间法（APTT）、凝血酶时间法（TT）等。
- 优点： 直接反映肝素在血浆环境中的整体抗凝活性。
- 缺点： 操作繁琐耗时，精密度相对较低，变异系数较大，结果易受动物个体差异、血浆批次、操作人员技术熟练度等因素影响。目前主要作为生色底物法的补充或验证方法。

二、肝素标准品与国际单位（IU）

肝素效价的表达必须依赖于国际标准品或国家标准品。世界卫生组织（WHO）提供肝素国际标准品，其效价以国际单位（IU） 精确标定。各国的国家药品检定机构（如中国的中国食品药品检定研究院NIFDC）会依据国际标准品标定建立本国的国家标准品。

定义： 1个国际单位（IU）肝素的效价定义为1mg WHO国际标准品肝素钠所具有的生物活性。
重要性： 标准品是效价测定的基准，所有供试品的效价都是通过与标准品在相同条件下的活性比较计算得出。没有标准品，就无法实现肝素效价的准确量化和全球统一。标准品的存在确保了不同实验室、不同时间、不同批次测定结果的可比性。

三、肝素效价检定的一般步骤（以生色底物法为例）

溶液配制：
- 标准品溶液： 精密称取肝素标准品，用适宜的缓冲液（如Tris缓冲液）溶解并稀释成一系列浓度梯度（通常为4-6个浓度），覆盖预期效价范围，形成标准曲线。
- 供试品溶液： 精密称取或量取待测肝素样品（原料药或制剂），同样用缓冲液溶解并稀释至与标准品中间浓度相当的预测效价浓度附近。通常做适当倍数稀释（如数百倍至上千倍）以适应测定范围。
- 试剂溶液： 按要求配制或复溶ATIII溶液、FXa（或FIIa）溶液、生色底物溶液。
反应体系与测定：
- 在微量反应板孔或比色皿中依次加入：
  - 缓冲液（空白对照）或不同浓度的标准品溶液/供试品溶液。
  - ATIII溶液。
  - FXa（或FIIa）溶液。
- 混合均匀，在精确控制的温度（通常37°C）和时间下孵育，使肝素-ATIII复合物充分形成并抑制部分活化凝血因子。
- 加入生色底物溶液启动显色反应。
- 立即置于分光光度计中，在405nm波长下连续监测吸光度（A）随时间的变化（通常记录数分钟），并计算吸光度变化速率（ΔA/min）。
数据处理与效价计算：
- 计算抑制率：抑制率(%) = [1 - (供试品或标准品ΔA/min) / (空白对照ΔA/min)] × 100%。
- 绘制标准曲线： 以标准品各浓度的对数（log浓度） 为横坐标（X），对应的抑制率（%）（或其转换值，如logit值）为纵坐标（Y），进行线性回归，得到标准曲线方程 Y = a + bX（直线化模型）。
- 计算供试品效价：
  - 将供试品测得的平均抑制率代入标准曲线方程，计算出供试品在测试浓度下的相对浓度（log值）。
  - 将该log值转换为实际浓度。
  - 根据供试品的标示量或标示浓度（如有）、稀释倍数和测试浓度，计算出供试品每毫克（或每支/每瓶）所含的肝素效价（IU/mg或IU/支/瓶）。
  - 计算公式通常表示为：供试品效价 = (Pr / Ps) × D × Es
    - Pr：由标准曲线计算得到的供试品相对浓度（单位需与标准品一致）。
    - Ps：供试品标示量或取样量（mg）。
    - D：供试品总的稀释倍数。
    - Es：所用标准品的标示效价（IU/mg）。
- 统计要求： 通常要求标准曲线的相关系数（r）≥0.99，实验设计需符合平行线检定法的基本原则（剂量对数与反应呈直线关系，且标准品与供试品的直线平行）。

四、关键影响因素与质量控制

试剂质量： FXa/FIIa、ATIII、生色底物的活性、纯度、批次稳定性至关重要。应使用可靠的供应商提供的符合要求的专用试剂盒或组分。
标准品： 必须使用准确标定的肝素标准品。标准品溶液的配制和稀释必须精密。
温度和时间控制： 反应的每一步（尤其是孵育和显色反应）都需要在恒温（通常37°C）下精确控制时间。
移液准确性： 微升级别的液体转移需要高精度的移液器和熟练的操作技术。
仪器性能： 分光光度计需定期校准，确保波长准确性和读数稳定性。
样品处理： 肝素在玻璃器皿上可能有吸附，稀释液选择（常用含白蛋白或聚山梨酯的缓冲液）和操作过程需注意。
人员操作： 操作人员需经过严格培训，熟悉规程。
系统适用性： 每次实验应包含足够的空白、标准曲线点以及可能的中质控品，验证方法的精密度和准确度在可接受范围内。重复测定次数需符合药典规定（通常至少双份，甚至更多）。

五、效价检定的意义与应用

质量控制和放行依据： 是肝素原料药、制剂生产过程中批放行的法定检验项目，确保产品符合标示效价要求。
标示量准确性： 验证药品标签上标注的效价单位（如XXXX IU/支）是否准确。
批次间一致性： 保证不同批次肝素产品的生物活性稳定均一。
工艺稳定性监控： 监控提取、纯化等生产工艺是否稳定。
稳定性研究： 考察肝素在储存过程中效价是否下降，确定有效期。
比较研究： 评估不同来源、不同工艺肝素产品的相对效价。

六、结论

肝素效价检定是保障肝素药品质量和临床疗效的核心生物测定技术。基于抗凝血酶增强活化因子抑制的生色底物法因其较好的精密度、准确度和标准化程度，已成为现代药典推荐的主流方法。其成功实施高度依赖于国际/国家标准品、高质量的试剂、严谨的实验设计、规范的操作流程和完善的质量控制体系。准确测定肝素效价，对于确保患者用药的安全有效具有不可替代的重要意义。