临床配伍微生物挑战试验

发布时间：2025-06-21 13:05:11 阅读量：2 作者：生物检测中心

临床配伍微生物挑战试验：原理、应用与关键考量

摘要： 临床配伍微生物挑战试验是评估静脉输注药物在临时配制（如混合、稀释）后，其防腐体系在预定使用条件下抑制或杀灭潜在污染微生物能力的关键方法。本试验对保障患者用药安全，特别是防止微生物污染引发的感染至关重要。本文系统阐述该试验的设计原理、操作要点、结果解读及法规依据。

一、 引言

在临床实践中，为满足治疗需求（如剂量调整、减少输注刺激等），常需将注射用药物（尤其是多剂量制剂）与特定溶媒（如生理盐水、5%葡萄糖注射液）或其他药物进行临时配伍。此过程可能改变药液理化性质（如pH、渗透压），进而影响制剂中原有防腐剂（如苯酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯类）或药物本身的抑菌/杀菌效力。微生物挑战试验正是模拟这种潜在污染风险，科学评价配伍后药液在临床使用期间能否有效抑制微生物生长的标准化方法。

二、 试验目的与核心价值

  1. 核心目的： 验证药物在与指定溶媒或其他药物配伍后，在规定储存条件和使用时长下，其防腐体系是否仍能有效抵御低水平微生物污染（模拟给药过程中可能发生的意外污染），防止微生物在药液中增殖达到危害水平。
  2. 保障患者安全： 防止因微生物（细菌、真菌）在输注药液中生长繁殖而导致的导管相关性血流感染、脓毒症等严重不良事件。
  3. 指导临床实践： 为医护人员提供科学依据，明确特定配伍液的储存时限和使用规范（如开瓶后多久内必须用完），确保超出标签说明的临时配伍操作的安全性。
  4. 支持法规要求： 是新药上市申请（NDA）、仿制药申请（ANDA）中证明多剂量制剂或需临时配伍制剂稳定性和相容性的重要组成部分，也是药典（如USP <51>, EP 5.1.3, ChP 1121）的基本要求。

三、 试验设计与关键要素

  1. 供试品准备：

    • 配伍液配制： 严格按照拟定的临床配伍方案（明确药物浓度、溶媒种类及体积、混合顺序、储存容器等）制备供试品溶液。需确保配制过程无菌操作，避免初始污染。
    • 对照品：
      • 阴性对照： 未接种微生物的配伍液样品，用于确认试验系统无菌性。
      • 阳性对照（生长对照）： 在合适的培养基（如胰酪大豆胨液体培养基TSB、流体硫乙醇酸盐培养基FTM）中接种微生物，用于确认试验菌株的生存能力和生长活力。
      • 产品阳性对照（可选但推荐）： 将微生物接种于不含防腐剂的药液（或经过验证能中和防腐剂的溶液）中，用于确认该配伍液本身是否支持微生物生长（排除抑菌性干扰）。
      • 防腐有效性对照（可选）： 未稀释/未配伍的原制剂作为对照，用于评估配伍对其防腐效力的影响。

  2. 挑战微生物选择：

    • 代表性菌株： 通常选用标准菌株，需涵盖革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus）、革兰氏阴性菌（如铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa、大肠埃希菌 Escherichia coli）、酵母（如白色念珠菌 Candida albicans）和霉菌（如黑曲霉 Aspergillus niger）。选择依据包括：
      • 常见于医院环境、包装材料、医护人员皮肤。
      • 对防腐剂的抵抗力存在差异。
      • 在药典或监管指南中有明确要求。
    • 菌株来源： 推荐使用官方菌种保藏机构（如ATCC）提供的标准菌株。

  3. 微生物接种：

    • 初始接种浓度： 通常为每毫升供试品接种10^5 - 10^6 CFU（菌落形成单位）的微生物。此浓度模拟严重意外污染水平。
    • 接种体积： 应足够小（通常<1%供试品体积），以避免显著稀释防腐剂或改变供试品性质。
    • 菌液制备： 使用新鲜培养物制备菌悬液，进行标准化稀释以达到目标接种浓度。需通过平板计数法验证接种浓度。

  4. 培养条件与时间点：

    • 培养温度： 通常在20-25°C进行，模拟室温储存环境（如输液架）。特定产品可能需要模拟冷藏（2-8°C）或体温（35-37°C）条件。
    • 培养时间： 试验需覆盖临床拟定的最长配伍后储存时限和使用时长（如4小时、8小时、24小时、48小时、7天、14天、28天等）。典型取样点包括：接种后即刻（T0，初始值）、6小时、24小时、48小时、7天、14天、28天等。
    • 厌氧条件（如适用）： 对于需氧和兼性厌氧菌，在需氧条件下培养（如TSB）。对于严格厌氧菌（如生孢梭菌 Clostridium sporogenes，根据药典要求），需在厌氧条件（如FTM）下培养。

  5. 取样与微生物计数：

    • 在预设时间点，从每个接种的供试品容器中无菌取样。
    • 采用适宜方法（如稀释平板法、薄膜过滤法）进行微生物定量计数，记录每毫升CFU数。
    • 计数方法需经验证，能有效中和或消除供试品中残留的防腐剂对微生物恢复生长的抑制作用（中和法/膜过滤法验证）。

四、 结果判定标准（基于主要药典原则，如USP <51>）：

微生物挑战试验的成功与否，取决于挑战菌株在规定时间内，其活菌数相较于初始接种量（T0）的下降程度（对数减少值，LRV）。核心要求通常包括：

  1. 细菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌）：
    • 14天： 活菌数对数值应下降不低于1.0 log（即减少90%）。
    • 28天： 活菌数对数值应下降不低于3.0 log（即减少99.9%），且在试验剩余时间内（如后续时间点）不得出现回升（反弹）。
  2. 真菌（白色念珠菌、黑曲霉）：
    • 14天及28天： 活菌数对数值不得低于初始值（T0）。允许有轻微下降或稳定，但禁止显著增殖。
  3. 关键时间点要求： 在临床使用中更早的时间点（如6小时、24小时、48小时、7天），通常也要求观察到的对数减少值符合特定标准（可能低于28天要求），以覆盖实际用药过程。
  4. 阴性对照： 在整个试验期间必须无菌生长。
  5. 阳性对照： 在24小时内应观察到显著的微生物生长（通常≥0.5 log增长），证明菌株活性良好。
  6. 产品阳性对照： 应显示微生物能良好生长，证明计数方法有效中和了抑菌性。

五、 试验关键考量与挑战

  1. 配伍稳定性： 试验结果高度依赖于配伍液的物理和化学稳定性。若配伍液在试验期内发生显著降解、浑浊或沉淀，可能干扰微生物计数或破坏防腐剂活性。
  2. 防腐剂中和/消除验证： 这是确保准确计数的核心前提。必须通过验证证明选用的计数方法（如特定稀释剂培养基中和法、膜过滤后冲洗）能有效消除供试品的抑菌性，使污染微生物得以恢复生长并被准确计数。
  3. 容器密闭系统： 试验使用的容器（如注射器、输液袋、西林瓶）应与临床实际使用的材质一致，其吸附性或透气性可能影响防腐剂效力及微生物生长。
  4. 初始污染水平（T0）准确性： T0值的准确测定至关重要，它是计算后续时间点对数减少值的基础。需在接种后立即搅拌均匀并尽快取样计数。
  5. 微生物反弹（Regrowth）： 某些情况下，微生物数量可能在某个时间点降至很低，但在后续时间点又出现增长（反弹），这通常表明防腐效力不足或失效。结果判定时需特别注意是否存在反弹现象。
  6. 依据特定产品特性的调整： 试验设计（如菌种选择、时间点设定、判定标准）应根据具体药品的特性、适应症、给药途径、预期患者人群（如免疫功能低下者）以及拟定的临床配伍方案进行科学论证和调整，并符合目标市场法规要求。
  7. 统计学考虑： 通常要求设置足够的平行样本（如每个时间点、每种菌至少2-3个独立容器），结果取均值进行分析。

六、 结论

临床配伍微生物挑战试验是评估静脉用药临时配伍后微生物安全性的基石。通过科学严谨的设计、规范的执行和准确的解读，该试验为证明配伍液在规定储存和使用条件下抵御微生物污染的能力提供了关键数据。其结果直接关系到医护人员的安全操作规范和患者的用药安全底线。在药物研发、注册上市及临床实践中，必须高度重视并严格遵循相关法规指南和科学原则进行微生物挑战试验，确保向患者提供安全有效的治疗药物。持续优化试验方法（如快速微生物检测技术的应用）和深化对防腐剂微生物作用机制的了解，将进一步提升该领域的科学性和保障水平。