细胞活性检测 - 中析研究所生物检测中心

细胞活性检测：方法与选择指南

细胞活性是评估细胞健康状态、生存能力及生理功能的核心指标，在生物医学研究（如药物筛选、毒性评价、细胞治疗）及基础细胞生物学中至关重要。它综合反映了细胞的代谢活力、膜完整性及增殖潜能。本文将系统介绍常见的细胞活性检测方法及其原理、优缺点，并提供选择指南。

一、核心检测方法分类

根据检测原理，主要可分为以下几类：

代谢活性检测：基于细胞酶促还原能力
- MTT法 (3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)：
  - 原理： 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶等能将黄色的MTT还原为不溶于水的蓝紫色甲臜(formazan)结晶，结晶溶解后可通过比色法定量。
  - 优缺点：
    - 优点： 应用广泛，成本相对较低。
    - 缺点： 需要溶解结晶（常用DMSO），步骤较繁琐；甲臜结晶可能聚集在细胞周围或培养板表面，影响准确性；对某些细胞类型（如原代细胞、悬浮细胞）敏感性可能较低；存在潜在细胞毒性，终点法不可逆。
- CCK-8法 (Cell Counting Kit-8)：
  - 原理： 利用水溶性的四唑盐WST-8，在细胞脱氢酶作用下被还原为高度水溶性的橙黄色甲臜产物，可直接在培养基中显色检测。
  - 优缺点：
    - 优点： 操作简便快速（“加样-孵育-检测”三步），无需溶解步骤，灵敏度通常高于MTT，对细胞毒性低，可进行连续监测。
    - 缺点： 试剂成本相对MTT更高；显色受pH、CO2浓度影响（通常在检测前需去除CO2影响）。
- XTT法 (2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰胺内盐)：
  - 原理： 类似于MTT，但被还原产生的水溶性甲臜可直接在培养基中检测。
  - 优缺点：
    - 优点： 无需溶解步骤。
    - 缺点： 还原速率通常低于MTT，常需加入电子偶联剂（如PMS）增强信号，增加了步骤和潜在毒性；灵敏度可能受限。
- 刃天青法/Resazurin法/Alamar Blue法：
  - 原理： 活细胞的代谢活性将氧化态（蓝紫色、无荧光）的刃天青还原为还原态（粉红色、强红色荧光）的试卤灵(resorufin)，可通过吸光度（570nm激发 / 600nm发射）或荧光（560nm激发 / 590nm发射）检测。
  - 优缺点：
    - 优点： 操作极其简单（直接加入培养基孵育后检测），灵敏度高，对细胞几乎无毒（可进行连续、实时监测），适用于高通量筛选。
    - 缺点： 背景信号可能较高；还原产物不稳定；荧光法易受培养基成分（如酚红）干扰。
膜完整性检测：基于细胞膜屏障功能
- 台盼蓝染色排除法：
  - 原理： 台盼蓝染料不能透过活细胞完整的质膜，但可进入膜受损的死细胞并将其染成蓝色。显微镜下或血球计数板/自动细胞计数仪下计数活细胞（不着色）和死细胞（蓝色）的比例。
  - 优缺点：
    - 优点： 原理直观，操作简便快捷，成本低廉，可直接观察细胞形态，是评估细胞存活率的经典金标准。
    - 缺点： 主观性较强（尤其是显微镜手动计数），通量低；不能区分凋亡细胞和早期坏死细胞；对细胞浓度有要求；染色时间过长活细胞也会摄取染料。
- 乳酸脱氢酶 (LDH) 释放法：
  - 原理： 胞浆酶LDH正常情况下存在于细胞内，当细胞膜严重受损（坏死）时会释放到培养基中。通过检测培养基中LDH催化底物（如四唑盐INT或WST）产生的显色/荧光产物，可定量细胞毒性（死细胞数量）。
  - 优缺点：
    - 优点： 操作相对简单（通常需要加裂解液测定最大LDH释放作为对照），适用于贴壁和悬浮细胞，可用于高通量筛选。
    - 缺点： 主要反映膜破裂的坏死细胞，对早期凋亡不敏感；血清中也含有LDH，需设立无细胞培养基对照；血清可能抑制LDH活性；结果受细胞裂解程度（如反复冻融）影响。
氧化还原指示剂法：
- ATP检测法：
  - 原理： 三磷酸腺苷 (ATP) 是细胞能量货币，活细胞含量高且稳定，死细胞ATP迅速降解。利用萤火虫荧光素酶系统催化荧光素氧化发光，光强度与ATP含量成正比，从而反映活细胞数量。
  - 优缺点：
    - 优点： 灵敏度极高，线性范围宽，操作简便快速，适用于高通量筛选。
    - 缺点： 试剂成本较高；需要专门的发光检测设备；残留ATP酶或剧烈处理可能干扰结果。
荧光染色法：基于细胞形态与染料摄取
- 核酸染料染色法：
  - 原理： 使用细胞膜通透性不同的荧光染料组合区分活、死、凋亡细胞。
    - 碘化丙啶 (PI) / 7-AAD等： 不能透过活细胞膜，但可透过死细胞膜与DNA结合产生红色荧光。常与能透过所有细胞膜的核酸染料（如Hoechst 33342、DAPI）联用，标记总细胞核。
    - Annexin V / PI双染法： 早期凋亡细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻，可被荧光标记的Annexin V特异性结合（绿色荧光）；PI用于区分死细胞（红色荧光）。这是检测凋亡和区分活/死细胞的常用方法。
  - 优缺点：
    - 优点： 可定量区分活细胞、凋亡细胞、坏死细胞；结合流式细胞术分析通量高、客观准确；可结合形态学观察（荧光显微镜）。
    - 缺点： 需要荧光检测设备（流式细胞仪、荧光显微镜、酶标仪）；操作步骤较多（染色、洗涤）；试剂成本较高。
- 钙黄绿素-AM / 碘化丙啶 (Calcein-AM/PI) 双染法：
  - 原理： 活细胞内的酯酶将非荧光、膜通透性的Calcein-AM水解为强绿色荧光的钙黄绿素（Calcein）并滞留在细胞内；PI标记死细胞核（红色）。可在显微镜下直观观察活（绿色）、死（红色）细胞。
  - 优缺点：
    - 优点： 直观，可同时可视化活细胞（胞质）和死细胞（核）。
    - 缺点： 需要荧光显微镜；定量分析不如流式便捷；Calcein可能会缓慢泄漏出活细胞。
克隆形成能力检测：
- 原理： 单个细胞在适宜条件下持续增殖形成可见的细胞集落（通常>50个细胞）。只有具有持续增殖能力的活细胞才能形成克隆。
- 优缺点：
  - 优点： 反映细胞的长期增殖活性和干细胞特性，是评估细胞毒性（尤其是放疗、化疗效果）的金标准之一，结果直观。
  - 缺点： 耗时长（1-3周），操作步骤多（铺板、培养、固定、染色、计数），通量低，主观性较大（计数）。

二、选择合适方法的考量因素

没有一种方法适用于所有情况。选择方法时应综合考虑：

检测目的：
- 单纯区分活/死细胞？台盼蓝、LDH、Calcein-AM/PI、PI单染。
- 评估代谢活性？MTT、CCK-8、XTT、Resazurin、ATP。
- 评估增殖速率？CCK-8/Resazurin连续监测、克隆形成。
- 区分凋亡与坏死？Annexin V/PI双染。
- 高通量筛选？CCK-8、Resazurin、ATP、LDH、基于96/384孔板的流式/成像。
- 长期细胞健康评估？克隆形成。
细胞类型：
- 贴壁细胞：多数方法适用。
- 悬浮细胞：避免需要洗涤的方法（易丢失细胞），优先选CCK-8、Resazurin、LDH、ATP或染色后直接上流式（无需洗涤）。
- 原代细胞、干细胞：代谢可能较弱，优先选灵敏度高的方法（如ATP、Resazurin、CCK-8）。
- 对染料敏感或有特殊代谢途径的细胞：需验证方法适用性。
样本通量与自动化需求：
- 少量样本：台盼蓝、显微荧光染色、克隆形成。
- 大批量样本（96/384孔板）：CCK-8、Resazurin、ATP、LDH、高内涵成像、流式高通量分析。
设备条件：
- 仅显微镜？台盼蓝、Calcein-AM/PI显微观察。
- 有酶标仪？适用MTT、CCK-8、XTT、Resazurin（吸光/荧光）、LDH、ATP（发光）。
- 有流式细胞仪？适用PI、Annexin V/PI、Calcein-AM/PI、多种荧光染料组合。
- 有高内涵成像系统？适用荧光染色法进行形态学定量分析。
时间与成本：
- 快速获得结果（分钟-小时）：台盼蓝、LDH、Calcein-AM/PI、ATP。
- 过夜（4-24小时）：MTT、CCK-8、XTT、Resazurin。
- 长期（周）：克隆形成。
- 成本敏感：台盼蓝、MTT相对经济；CCK-8、Resazurin、ATP、荧光染料成本较高。
是否需要无损/连续监测？
- 需要： Resazurin、CCK-8（在合适孵育时间下）、某些无标记技术（如阻抗法）。
- 终点法即可： MTT、XTT、LDH、台盼蓝、固定后染色。

新兴技术：实时无标记细胞分析 (RTCA / xCELLigence类技术)

原理： 通过微电极阵列检测细胞贴附、增殖、形态变化引起的阻抗变化，实时、动态、无标记地监测细胞状态（包括活性、增殖、迁移、侵袭）。
优点： 无需标记，实时连续监测，可获取动力学信息，减少干扰和操作误差（如染料毒性、洗涤损失），适用于多种生物学过程研究。
缺点： 设备昂贵，专用耗材成本高，信号反映的是细胞与电极的综合作用（贴附、形态、数量），对悬浮细胞、非贴附状态细胞或形态变化剧烈的细胞（如某些免疫细胞活化）解释较复杂。

三、结论

细胞活性检测是生命科学研究中的基石技术。理解各种方法的原理、优缺点及应用范围，结合具体的研究目标（目的、细胞类型、通量、设备、时间、成本等）进行审慎选择，是获得可靠、有生物学意义数据的关键。随着技术的发展，更高灵敏度、更快速、更自动化、无标记且能提供更多维度信息（如形态、动态过程）的新方法不断涌现。研究人员应持续关注并评估这些新技术在特定应用场景下的价值和潜力，以推动研究的深入。