体外不同指示细胞接种培养法检测病毒因子

发布时间：2025-06-21 12:03:06 阅读量：4 作者：生物检测中心
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体外不同指示细胞接种培养法检测病毒因子：原理与应用指南

摘要： 体外指示细胞接种培养法是一种经典的病毒分离与检测技术，通过在特定细胞系中接种待检样本并观察细胞病变效应（CPE）或采用特定检测方法（如免疫荧光、PCR）来鉴定未知或可疑病毒因子。利用多种具有不同病毒易感谱系的指示细胞组合接种，可显著提高病毒检测的广谱性和成功率。本文详细阐述该方法的原理、操作流程、常用指示细胞系选择、优势与局限性及其在病毒学研究与诊断中的应用要点。

一、 核心原理

病毒是严格细胞内寄生的微生物。该方法的核心在于利用体外培养的、对特定病毒或病毒群高度易感的“指示细胞”（Indicator Cells）。当待检样本（如临床标本、环境样本、生物制品）接种于这些细胞后：

  1. 病毒吸附与侵入： 样本中存在的活病毒（若存在）吸附并侵入指示细胞。
  2. 病毒： 病毒在细胞内利用宿主细胞器进行。
  3. 产生可观测效应： 病毒可导致：
    • 细胞病变效应： 细胞形态发生特征性改变，如圆缩、聚集、融合、脱落、颗粒增多或形成包涵体等（显微镜下观察）。
    • 血凝/血吸附： 某些病毒（如流感病毒）可在感染细胞表面表达血凝素，使红细胞吸附在其表面。
    • 干扰现象： 某些病毒先感染细胞后，能干扰后续接种的特定攻击病毒的。
    • 抗原表达： 病毒特异性抗原在细胞内或细胞表面表达（可通过免疫荧光、免疫酶标等方法检测）。
    • 核酸释放： 病毒基因组释放到培养上清或细胞内（可通过PCR、测序等方法检测）。
  4. 多细胞系互补： 不同细胞系对不同病毒家族的易感性存在显著差异。单一细胞系可能遗漏许多病毒。因此，同时或依次接种多种指示细胞至关重要，通过覆盖不同病毒易感谱，最大限度地捕获潜在的多种病毒因子。

二、 主要操作流程

  1. 样本前处理：

    • 来源： 根据检测目的采集（如咽拭子、粪便、组织匀浆液、血清、细胞培养上清、环境拭子等）。
    • 处理： 通常需进行澄清（低速离心）、过滤（除菌过滤膜，孔径常为0.22或0.45μm以去除细菌/真菌）或抗生素处理（加入适量抗生素如青霉素、链霉素、两性霉素B或商品化抗生素混合物）。
    • 分装保存： 处理后的样本及时接种或分装冻存于-70℃或液氮中备用。

  2. 指示细胞准备：

    • 选择： 根据目标病毒谱或广谱筛查需求，选择至少2-3种互补性强的细胞系（见下文“常用指示细胞系”）。
    • 培养： 细胞常规传代培养于含适宜培养基（如MEM, DMEM, RPMI 1640）和胎牛血清的培养瓶/皿/板中，维持于37℃, 5% CO₂培养箱。
    • 接种准备： 待细胞生长至接近单层融合（约80-90%密度），消化、计数后接种至多孔板（如24孔板、96孔板）或培养瓶/管中，形成新鲜、健康的单层备用。接种密度需保证在观察期内能形成良好单层。

  3. 样本接种与吸附：

    • 清洗细胞： 移除细胞培养基，用无菌PBS或平衡盐溶液轻柔洗涤细胞单层1-2次，去除残余血清（可能含非特异性抑制物）。
    • 接种样本： 将适量处理过的样本（通常每孔/瓶100-500μL，具体体积依据容器大小调整）接种到细胞单层上。每种样本需平行接种到选定的多种指示细胞上。 设立阳性对照（已知病毒接种相应易感细胞）和阴性对照（仅加维持液或模拟处理的阴性样本）。
    • 吸附： 将接种后的培养容器置于培养箱中（通常37℃, 5% CO₂）孵育1-2小时，使病毒充分吸附于细胞。期间定期轻轻晃动容器以使样本均匀覆盖单层。

  4. 维持培养与观察：

    • 添加维持液： 吸附结束后，移除接种物（或保留部分，视情况而定），加入含较低浓度血清（通常0.5-2%）及抗生素的维持培养基。
    • 培养与观察： 置于培养箱中继续培养。逐日或隔日在倒置显微镜下仔细观察各指示细胞系的形态变化（CPE）。 记录CPE出现的时间、特征（如细胞圆缩、巨细胞化、融合、脱落、颗粒状、拉网状等）及涉及孔的比例。
    • 盲传： 若观察期内（通常7-14天，某些病毒如巨细胞病毒可能需更久）未观察到CPE，可将培养上清（有时连同细胞）收集，接种到新的同种或不同种新鲜指示细胞单层上（盲传1-3代），以扩增可能存在的低滴度病毒。
    • 辅助检测： 在观察到可疑CPE或预定观察期结束时（无论有无CPE），可进行：
      • 血凝/血吸附试验： 针对流感、副流感、腮腺炎等病毒。
      • 免疫学检测： 免疫荧光法（IFA）、免疫过氧化物酶法（IP）、酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞内或上清中病毒特异性抗原。
      • 分子生物学检测： 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、实时荧光定量PCR（qPCR）或高通量测序（NGS）检测病毒核酸。

  5. 结果判读：

    • 阳性： 在一种或多种指示细胞系上观察到特征性CPE，并经辅助检测（如IFA、PCR）确认为目标病毒或新病毒；或未观察到明显CPE但辅助检测结果阳性。
    • 阴性： 在所有指示细胞系上经过足够培养时间（包括盲传）后均未观察到CPE，且所有辅助检测结果均为阴性。阳性对照需生长良好，阴性对照需无污染和异常。

三、 常用指示细胞系及其选择依据

选择指示细胞应基于其病毒易感谱的广度和互补性。常用组合包括：

表：常用指示细胞系及其敏感的主要病毒群示例

选择策略：

  • 目标明确筛查： 根据可疑病毒类型选择其最敏感的1-2种细胞系（如流感用MDCK，CMV用MRC-5）。
  • 广谱未知病毒筛查： 必须组合使用，常用组合如：Vero + RD + A549（覆盖呼吸道、肠道及广谱病毒）；或 Vero + MRC-5 + MDCK（覆盖广谱、疱疹病毒、流感病毒）。根据样本来源（如呼吸道、粪便、CSF）可调整侧重。
  • 提高阳性率： 对于难分离病毒或低病毒载量样本，使用多种细胞系并行接种比单一细胞系更有效。

四、 方法优势与局限性

  • 优势：

    1. 检测活性病毒： 核心优势是能检测具有感染性的活病毒颗粒，这是核酸检测（只能检测核酸存在）和抗原检测（只能检测抗原存在）无法替代的。
    2. 病毒分离基础： 是获取活病毒毒株进行后续特性研究（如血清分型、药物敏感性、致病性）的唯一途径。
    3. 广谱筛查能力： 多指示细胞组合可同时筛查多种不同种类的病毒，甚至发现未知或新发病毒（结合NGS等）。
    4. 直观： CPE形态学观察相对直观（需经验）。
    5. 无需预设目标： 对未知病原体调查尤为重要。

  • 局限性：

    1. 耗时长： 培养观察期通常需数天至数周，远慢于分子检测（几小时）。
    2. 灵敏度限制： 病毒载量过低、样本中含有抑制物或病毒体外难培养时，可能检测不到。
    3. 技术要求高： 需要熟练的细胞培养技术、无菌操作、准确的CPE识别能力及配套的实验室条件（如CO₂培养箱、显微镜）。
    4. 成本较高： 细胞培养、培养基、血清等消耗品成本，以及人工成本。
    5. 细胞系局限性： 没有一种细胞系能分离所有病毒。即使组合使用，仍有部分病毒（如肝炎病毒、某些细小病毒、诺如病毒）难以或不能在常规细胞系中培养。
    6. 主观性： CPE观察和判断存在一定主观性，需要经验丰富的技术人员。
    7. 生物安全风险： 操作未知病原体样本具有潜在的生物安全风险，需在相应生物安全级别（BSL）实验室进行。

五、 关键应用场景

  1. 临床病毒学诊断：
    • 疑难感染性疾病病原体的分离鉴定（如无菌性脑膜炎、原因不明发热、严重呼吸道感染、皮疹性疾病）。
    • 病毒性疾病的病原学确认（尤其在分子方法阴性但仍高度怀疑病毒感染时）。
    • 获取病毒株用于耐药性检测或流行病学溯源。
  2. 新发与再现传染病研究： 发现和鉴定未知的新型病毒。
  3. 疫苗生产与质控： 疫苗生产种子库和工作种子库的外源病毒因子检测（需遵循严格法规，如WHO、各国药典要求）。
  4. 生物制品安全评估： 细胞基质、血清、其他生物原材料中潜在病毒污染物的检测。
  5. 环境监测： 水源、食品等环境样本中病毒的检测与分离。
  6. 基础病毒学研究： 病毒分离、扩增、滴定、生物学特性研究（如宿主范围、动力学、CPE机制）。

六、 质量保证与注意事项

  1. 细胞质量控制： 使用来源清晰、无支原体等污染、活力良好的低代次细胞。定期进行无菌试验和外源因子检查。
  2. 无菌操作： 严格无菌操作是避免细菌/真菌污染导致假阴性或假阳性的关键。
  3. 对照设置： 每次实验必须设立明确的阳性对照（证明细胞易感性和方法有效性）和阴性对照（排除背景干扰和污染）。
  4. 标准化操作程序： 建立并严格遵守详细的标准操作程序（SOP）。
  5. 显微镜校准与观察： 定期校准显微镜，由经验丰富的技术人员进行CPE观察记录。
  6. 生物安全： 严格遵守实验室生物安全规范，根据样本风险等级在相应BSL实验室操作，使用个人防护装备（PPE），废弃物规范处理。
  7. 结果验证： 观察到的CPE或初步阳性结果，必须通过辅助方法（如IFA、PCR、测序）进行特异性验证。
  8. 记录完整： 详细记录实验过程、观察结果、试剂批号、细胞代次、操作人员等信息。

结论

体外不同指示细胞接种培养法作为病毒学研究的基石技术之一，在检测具有感染性的活病毒方面具有不可替代的价值。通过精心选择具有互补性病毒易感谱的多种指示细胞系组合接种，可显著提高病毒分离的成功率和检测的广谱性，适用于临床诊断、新发传染病防控、疫苗和生物制品安全性评价以及基础研究等多个领域。尽管存在耗时较长、技术要求和成本较高等局限性，结合分子生物学等辅助检测手段，该方法依然是病毒鉴定、分离和研究活病毒生物学特性的核心策略。掌握其原理、精通操作技巧并严格实施质量控制是确保检测结果准确可靠的关键。