细胞形态观察及血吸附试验：原理与应用详解
引言 在病毒学、细胞生物学及疫苗研发领域，准确评估细胞的健康状态、识别病毒感染迹象至关重要。细胞形态学观察和血吸附试验（Hemadsorption Test, HAd）是两项经典、互补且实用的体外检测技术。它们操作相对简便，结果直观，为研究人员提供了早期识别细胞病变效应（CPE）和特定病毒感染的重要窗口。
一、 细胞形态观察
1. 基本原理 细胞形态观察是最基础的细胞学检测方法，通过显微镜直接观察培养细胞的形态结构、排列方式、生长密度、透明度以及是否存在异常变化（如颗粒增多、空泡形成、融合、圆缩、脱落等），以此判断细胞的生长状态、活力以及是否受到微生物（细菌、真菌、支原体）或病毒等因素的影响。
2. 仪器与方法
- 主要仪器： 光学显微镜是最常用的工具。倒置显微镜因可直接观察培养瓶/培养板中的贴壁细胞而更为便捷。
- 常用染色（非必需，但增强对比）：
- 台盼蓝染色： 鉴别死细胞（蓝色）与活细胞（不着色），评估细胞存活率。
- 吉姆萨/瑞氏染色： 常用于细胞涂片，使细胞核、胞质及颗粒染色，更清晰地观察细胞内部结构，识别特定细胞类型或病变。
- 观察要点：
- 生长状态： 细胞是否贴壁良好（贴壁细胞）、分布是否均匀、密度是否合适（汇合度）。正常细胞通常形态规则（如成纤维细胞呈梭形，上皮样细胞呈铺路石状）。
- 活力与健康： 细胞轮廓是否清晰、折光性是否良好、胞质是否均质透明、有无颗粒或空泡。
- 病变效应：
- CPE： 病毒感染后常见的形态变化，包括细胞圆缩、聚集、融合形成合胞体、颗粒增多、形成包涵体、细胞裂解脱落等。不同类型的病毒可能产生特征性的CPE。
- 微生物污染： 细菌污染可见培养基迅速浑浊、pH急剧下降（酚红指示剂变黄）；真菌污染可见菌丝或孢子团；支原体污染通常引起细胞生长缓慢、状态不佳、颗粒增多，需特殊染色或PCR确认。
- 背景杂质： 观察有无黑点、纤维状物等物理杂质。
3. 应用
- 日常监控细胞培养状态和健康度。
- 初步筛查细胞培养物是否被细菌、真菌或支原体污染。
- 检测和初步鉴定病毒感染（通过观察特征性CPE）。
- 评估细胞毒性作用（如药物、毒素处理）。
4. 优缺点
- 优点： 操作简便、快速、成本低、结果直观。
- 缺点：
- 主观性较强，依赖观察者经验。
- 灵敏度有限，轻微的病变或低滴度感染可能不易察觉。
- 特异性不强，相似的形态变化可能由不同原因（如不同病毒、非特异性毒性）引起，需要结合其他方法验证。
- 难以区分无CPE的病毒种类。
二、 血吸附试验
1. 基本原理 血吸附试验（HAd）是一种特异性检测某些病毒（主要是副粘病毒科、正粘病毒科、披膜病毒科的部分成员）感染的体外试验。其原理基于这些病毒在感染宿主细胞后，会在被感染细胞的表面表达病毒编码的血凝素（Hemagglutinin, HA）糖蛋白。这种血凝素能够识别并结合特定种类红细胞（如豚鼠、鸡、人“O”型血红细胞等）表面的受体，导致红细胞吸附在受感染的细胞表面。未感染细胞则不会吸附红细胞。
2. 试剂与材料
- 红细胞悬液： 最常用的是豚鼠红细胞，也可根据目标病毒的特性选择鸡、猴或人“O”型红细胞（需无菌采集并用抗凝剂处理）。使用前通常洗涤并用缓冲液（如PBS或Hank's平衡盐溶液）配制成0.4%-1.0%的悬液。
- 细胞培养物： 待检的细胞培养物（可能是待测样本接种后的培养物，或需要检测潜在病毒污染的细胞库细胞）。
- 缓冲液： PBS或其他等渗缓冲液，用于洗涤细胞和配制红细胞悬液。
- 低温设备： 试验通常在4℃（某些病毒也可在室温）进行。
3. 操作步骤
- 准备细胞： 将待检测的单层细胞（通常培养在瓶、皿或孔板中）用预冷的缓冲液轻柔洗涤1-2次，去除培养基中的血清（血清可能抑制血凝）。
- 加入红细胞： 向洗涤后的细胞表面加入足量预冷的0.4%-1.0%红细胞悬液，确保覆盖整个单层。
- 孵育吸附： 将培养容器置于4℃冰箱（或特定要求的温度）中孵育20-60分钟（时间需优化）。低温利于红细胞吸附但不易发生内化。
- 洗涤与观察：
- 轻柔洗涤法： 小心吸弃红细胞悬液，用大量预冷缓冲液沿器壁缓慢加入数次，轻柔冲洗掉未吸附的游离红细胞（避免冲散单层）。
- 沉降法 (适用于孔板)： 吸弃红细胞悬液后，将孔板倒置在吸水纸上轻拍几次，去除游离红细胞。
- 显微镜观察： 将细胞置于倒置显微镜下观察（通常使用低倍镜，如4×或10×）。重点观察细胞单层表面是否有吸附的红细胞颗粒或团块。阳性结果通常在细胞周围或整个单层上清晰可见密集吸附的红细胞。
4. 结果判读
- 阳性 (+)： 在显微镜下清晰可见大量红细胞吸附在细胞单层上，呈现颗粒状或团块状外观。吸附的红细胞常围绕着单个感染细胞或感染灶分布。
- 阴性 (-)： 细胞单层表面光滑、干净，几乎没有或仅有极少量散在的未被洗脱的红细胞。背景清晰。
- 非特异性吸附： 偶尔可能因细胞损伤、死亡或操作问题产生少量红细胞粘附，但这种吸附通常散在、无规律且强度远低于特异的病毒感染阳性结果。
5. 应用场景
- 检测无CPE或CPE不明显的特定病毒感染： 这是HAd的核心价值所在。例如，某些副流感病毒、腮腺炎病毒等感染某些细胞系时可能不产生明显CPE，但可通过HAd检测到。
- 鉴定病毒种类： 结合红细胞种类选择（种属特异性）、吸附温度、解离条件等，可作为初步鉴别病毒种类的辅助手段（例如，流感病毒与副流感病毒对不同红细胞的吸附特性不同）。
- 病毒滴定： 通过观察出现血吸附现象的孔/瓶的比例，可以计算病毒的感染滴度（如HAd₅₀）。
- 细胞库外源病毒因子检测： 作为生物制品（如疫苗）质量控制中，检测细胞基质是否潜伏携带特定血吸附性病毒的标准方法之一（常与血凝试验结合）。
- 分离病毒初筛： 在病毒分离培养过程中，对未出现CPE的培养物进行HAd检测，判断是否有血吸附性病毒生长。
6. 优缺点
- 优点：
- 特异性较强，针对表达功能性血凝素的病毒。
- 灵敏度较高，即使个别细胞感染也可能被观察到（形成吸附灶）。
- 结果直观可见。
- 操作相对简便，成本适中。
- 缺点：
- 仅适用于表达血凝素蛋白并能将其定位到细胞膜上的病毒。对许多无此特性的病毒（如大多数疱疹病毒、肠道病毒、腺病毒早期感染等）无效。
- 需要新鲜的、活性良好的红细胞。
- 操作过程（特别是洗涤步骤）需要小心谨慎，避免假阴性（洗脱过度）或假阳性（洗脱不足）。
- 红细胞保存期有限。
- 不能区分具体是哪种血吸附性病毒（需结合其他方法）。
- 存在极低的红细胞携带外源病毒的风险（需使用来源可靠的动物）。
三、 细胞形态观察与血吸附试验的协同应用
这两项技术在实践中常常联合使用，相互补充：
- 初步筛查： 首先依靠显微镜进行常规的形态学观察，快速判断细胞状态、发现明显的CPE或污染。
- 深入检测： 当形态学观察未发现明显CPE，但临床或实验线索提示可能存在病毒感染（如接种样本后细胞状态变差但无明显病变），特别是怀疑为副粘、正粘等具有血凝素的病毒时，进行血吸附试验是关键的下一步。它能揭示形态学观察无法检测到的感染。
- 结果验证： 形态学观察到疑似病毒感染病变（如合胞体形成），进行HAd试验阳性可进一步支持这是由血吸附性病毒引起的。反之，HAd阳性但无CPE，也提示该病毒感染在该细胞系中不产生病变。
- 全面评估： 在细胞库检定或生物制品安全性检测中，这两项通常是外源病毒因子检测套餐中的基本组成部分，共同提高检测的覆盖范围和可靠性。
四、 注意事项与质量控制
- 对照设置： 至关重要！
- 阴性细胞对照： 确认未感染的正常细胞不吸附红细胞（排除非特异性吸附）。同批次的健康细胞即可。
- 阳性病毒对照： 使用已知能引起强血吸附的标准病毒株（如仙台病毒）感染细胞，确保本次试验系统（细胞、红细胞、操作流程）有效。这是判断试验有效性的关键。
- 红细胞自发凝集对照： 将红细胞悬液加入无细胞的缓冲液或空孔中，观察是否发生自发凝集（应不发生）。
- 试剂对照 (可选)： 红细胞悬液加入已知阴性的培养基残留物，观察是否有抑制吸附现象。
- 红细胞选择与保存： 根据目标病毒选择最敏感的红细胞种类（豚鼠红细胞最常用）。红细胞应新鲜（最好使用当天采集），或正确抗凝保存（一般4℃保存不超过1周，过期或溶血红细胞不能用）。使用前充分洗涤去除血浆蛋白和抗凝剂。
- 无菌操作： 整个试验过程需在生物安全柜内进行，遵守相应的生物安全等级（BSL-2常见）要求，防止可能的病毒暴露和实验室污染。
- 温度控制： 孵育温度（通常4℃）和时间需根据病毒特性和实验室条件优化并保持一致。
- 洗涤技巧： 这是关键步骤。力度过大会冲掉吸附的红细胞（假阴性），力度不足则残留过多游离红细胞干扰判断（假阳性或背景不清）。需通过练习掌握。
- 及时观察： 洗涤后应尽快在显微镜下观察结果，放置时间过长可能导致吸附的红细胞脱落或形态改变。
五、 总结
细胞形态学观察和血吸附试验是病毒学研究和生物制品质量控制中不可或缺的经典技术。形态学观察提供了细胞整体健康和病变状态的宏观视图，是日常监控的基石。血吸附试验则针对性地检测那些能够表达功能性血凝素蛋白并在细胞表面介导红细胞吸附的特定病毒群体，尤其在揭示无CPE或弱CPE的感染方面具有独特优势。
两者结合使用，能够更全面、灵敏地监测病毒感染和细胞状态。理解它们的原理、熟练掌握操作要点（特别是设对照和洗涤）、客观准确地判读结果，对于获得可靠的科学数据、保障生物制品的安全性以及准确诊断病毒感染至关重要。虽然分子生物学方法日益普及，但这些基于细胞学表型的经典方法因其直观性、可靠性和成本效益，在特定应用场景下依然具有不可替代的价值。
参考文献 (示例)
- Freshney, R. I. (2016). Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (7th ed.). Wiley-Blackwell. (涵盖细胞形态观察和基础培养技术)
- World Health Organization (WHO). (2013). Recommendations for the evaluation of animal cell cultures as substrates for the manufacture of biological medicinal products and for the characterization of cell banks. WHO Technical Report Series, No. 978, Annex 3. (包含病毒检测方法如HAd的要求)
- Baron, S., & Albrecht, T. (1996). Detection of Viral Infections in Cell Culture. In Baron S (Ed.), Medical Microbiology (4th ed.). University of Texas Medical Branch at Galveston. (描述包括CPE和HAd在内的病毒检测方法)
- Leland, D. S., & Ginocchio, C. C. (2007). Role of Cell Culture for Virus Detection in the Age of Technology. Clinical Microbiology Reviews, 20(1), 49–78. (讨论传统方法与新技术的比较)
- American Type Culture Collection (ATCC). Virology Guide: Fundamental Techniques for Virus Culture and Identification. (提供标准化的病毒培养和鉴定技术指南)
表：细胞形态观察与血吸附试验关键特性对比