以下是关于Western Blotting（蛋白质免疫印迹）实验技术的完整介绍，内容基于科学原理和标准化操作流程，不包含任何企业或商业名称：
Western Blotting技术原理
Western Blotting是一种结合凝胶电泳分离与抗原-抗体特异性反应的蛋白检测技术。其核心步骤包括：
- 蛋白分离：通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）按分子量大小分离蛋白质。
- 蛋白转印：将凝胶中的蛋白质电转移至固相载体（如PVDF膜或硝酸纤维素膜）。
- 免疫检测：利用一抗特异性结合目标蛋白，再通过酶标或荧光标记的二抗进行信号放大与检测 1。
完整实验流程
一样品制备
- 细胞裂解：
- 使用裂解缓冲液（如RIPA或NP-40缓冲液）破碎细胞，添加蛋白酶抑制剂防止降解。
- 离心（12,000 rpm，4℃，15分钟）后取上清液 9 26。
- 组织处理：
- 组织速冻后匀浆，按比例加入裂解液（如0.1 g组织/300 μL裂解液）。
- 离心取上清，测定蛋白浓度（如BCA法） 9 26。
- 蛋白变性：
- 样品与上样缓冲液（含SDS还原剂）按4:1混合，100℃煮沸5分钟 9 26。
二SDS-PAGE电泳
- 凝胶选择：
- 根据目标蛋白分子量选择凝胶浓度（例如：<40 kDa用15%胶，>100 kDa用8%胶） 9 16。
- 上样与电泳：
- 每孔上样20–30 μg总蛋白，搭配预染蛋白分子量标准。
- 恒压（100 V）电泳1–2小时，至溴酚蓝前沿达凝胶底部 9 16。
三蛋白转印
转印方法选择与步骤：
操作要点：
- 膜处理：PVDF膜需甲醇活化15秒，水洗后平衡于转印缓冲液；硝酸纤维素膜可直接使用。
- 转印层组装：顺序为海绵垫→滤纸→凝胶→膜→滤纸→海绵垫，逐层去除气泡 1 9 16。
四免疫检测
- 封闭：
- 膜浸入3–5%脱脂牛奶或BSA的TBST溶液，室温摇动1小时，阻断非特异性结合 9 16。
- 一抗孵育：
- 用封闭液稀释一抗，4℃孵育过夜（或室温2小时）。
- TBST洗涤3次，每次5分钟 9 16。
- 二抗孵育：
- 加入酶标（HRP/AP）或荧光标记二抗，室温避光孵育1小时，TBST彻底洗涤 9 16。
- 信号检测：
- 化学发光法：底物反应后，暗室曝光或成像仪采集光信号。
- 荧光法：直接成像，适用于多重检测 16。
五结果分析
- 通过目标条带位置（分子量）及信号强度，定性或半定量分析蛋白表达水平。
关键优化与注意事项
- 转印效率提升：
- 大分子量（>80 kDa）蛋白：转印缓冲液添加0.01–0.05% SDS 1 33。
- 小分子量肽段（<20 kDa）：缩短凝胶平衡时间至10分钟，采用0.2 μm孔径膜 1 33。
- 背景控制：
- 封闭液需过滤去除颗粒；洗涤缓冲液加入0.05% Tween-20减少非特异结合 33。
- 避免膜干燥，操作全程戴手套以防污染 33。
- 抗体重复使用：
- 一抗可添加防腐剂（如0.05%叠氮钠，但HRP体系需避免），重复不超过3次 33。
- 多重检测：
- 荧光法：不同通道激发的二抗可同时检测多靶点；化学发光法则需剥离后重孵育抗体 33。
常见问题与解决方案
参考文献
本技术总结基于分子生物学标准化操作及学术文献，详细步骤可参考专业实验手册
191626。