荧光定量PCR实验技术

荧光定量PCR实验技术：原理流程与应用

一技术概述

荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）是一种在PCR扩增过程中通过荧光信号实时监测产物累积量的核酸定量技术。该技术诞生于20世纪90年代中期，其核心突破在于将荧光标记系统与PCR扩增相结合，实现对起始模板的精确定量[[网页83]]。与传统PCR相比，qPCR具备以下优势：

• 闭管操作：避免扩增产物污染，提高重复性；
• 实时监测：通过荧光信号动态分析扩增进程；
• 高灵敏度与宽定量范围：可检测单拷贝基因，定量范围达6–8个数量级；
• 多重检测能力：支持多靶标同步分析[[网页1]][[网页27]]。

二技术原理

1. 化学原理

qPCR的荧光信号生成依赖两类标记策略：

• 探针法（如TaqMan）： 使用特异性寡核苷酸探针，5'端标记报告荧光基团，3'端标记淬灭基团。探针完整时，荧光共振能量转移（FRET）使报告基团荧光被淬灭；PCR扩增时，Taq DNA聚合酶的5'→3'外切酶活性切割探针，报告基团与淬灭基团分离，释放荧光信号。信号强度与产物量成正比[[网页83]][[网页1]]。
• 染料法（如SYBR Green I）： 荧光染料非特异性嵌入双链DNA小沟，结合后荧光强度增强数十倍。优点是成本低操作简便；缺点是易受非特异性产物（如引物二聚体）干扰，需通过熔解曲线验证产物特异性[[网页1]][[网页27]]。

2. 数学原理

• Ct值（Threshold Cycle）：荧光信号达到设定阈值时的循环数，与起始模板量呈负相关（即模板量越高，Ct值越小）[[网页1]][[网页10]]。
• 定量模型：
  • 绝对定量：通过标准曲线（已知浓度梯度的标准品）计算初始模板的精确拷贝数或浓度，适用于病毒载量检测等[[网页10]]。
  • 相对定量：采用2^–ΔΔCt法比较不同样本间基因表达差异。公式为： ΔΔ��=[��目的基因,实验组−��内参基因,实验组]−[��目的基因,对照组−��内参基因,对照组]ΔΔCt=[Ct目的基因,实验组​−Ct内参基因,实验组​]−[Ct目的基因,对照组​−Ct内参基因,对照组​] 基因表达倍数变化 = 2−ΔΔ��2−ΔΔCt[[网页10]][[网页20]]。
• 扩增效率（E）：理想值为100%（E=2），实际要求E在90%–110%之间；可通过标准曲线斜率计算（�=10−1/斜率−1E=10−1/斜率−1）[[网页27]]。

三实验流程

1. 实验设计

• 样本分组：明确对照组与实验组，设置生物学重复（≥3次）及技术重复（≥2孔）以减少误差；
• 对照设置：
  • 阴性对照（NTC）：无模板对照，检测污染；
  • 无反转录对照（NRT）：未反转录的RNA样本，验证基因组DNA残留[[网页20]]。

2. 核酸提取与质控

• RNA提取：使用防RNase污染的试剂与耗材，液氮速冻组织或细胞后裂解[[网页10]]。
• 质控要求：
  • 纯度：分光光度计检测A₂₆₀/A₂₈₀≈2.0，A₂₆₀/A₂₃₀≥2.0；
  • 完整性：琼脂糖凝胶电泳观察28S/18S rRNA条带比例≈2:1[[网页20]][[网页10]]。

3. 反转录（RT）

将RNA逆转录为cDNA，需验证反转录效率一致性：

• 使用高效逆转录酶，避免温度波动；
• 对高中低丰度基因同步检测，确保不同模板的反转录效率稳定[[网页20]][[网页27]]。

4. 引物与探针设计

• 引物设计原则：
  • 长度17–25 bp，GC含量40–60%；
  • 扩增片段80–250 bp，跨外显子连接区（避免基因组扩增）；
  • 3'端避免连续G/C或T，末端碱基优选G/C；
  • 通过BLAST验证特异性[[网页10]][[网页27]]。
• 探针设计要点： 长度30–45 bp，Tm值比引物高5℃以上，5'端避免G碱基[[网页27]]。

5. qPCR扩增与检测

• 反应体系优化：调整引物浓度Mg²⁺浓度，避免抑制剂残留；
• 程序设置：
  • 预变性（95℃，5 min）→ 循环阶段（95℃变性，60℃退火/延伸，40–45循环）；
  • 熔解曲线分析（染料法）：60–95℃缓慢升温，验证产物单一性[[网页1]][[网页10]]。

6. 数据分析

• 标准曲线法（绝对定量）：Log(起始浓度)与Ct值线性回归，计算未知样本浓度；
• 2^–ΔΔCt法（相对定量）：以内参基因（如GAPDHβ-actin）校正样本间差异[[网页10]][[网页27]]。

四质量控制与标准化

• MIQE指南：国际qPCR实验标准，规范实验设计样本信息核酸质控数据分析等流程，确保结果可重复性与可靠性[[网页20]]。
• 关键质控点：
  • 扩增效率验证（90%–110%）；
  • 熔解曲线单一峰；
  • 阴性对照无扩增（Ct值＞35或无信号）[[网页20]][[网页27]]。

五应用领域

1. 临床诊断：病毒载量检测（肝炎HIV）、遗传病筛查（地中海贫血）肿瘤标志物分析；
2. 基础研究：基因表达差异表观遗传修饰单核苷酸多态性（SNP）检测；
3. 农业与食品安全：转基因成分鉴定食源性致病微生物检测；
4. 动物疫病防控：禽流感病毒口蹄疫病毒定量监测[[网页83]][[网页1]]。

六常见问题与优化

1. 扩增效率异常：
   • 低于90%：引物二聚体或抑制剂干扰→优化引物浓度纯化模板；
   • 高于110%：非特异性扩增→重新设计引物或提高退火温度[[网页27]]。
2. 熔解曲线多峰：存在非特异性产物→优化退火温度或改用探针法[[网页1]]。
3. 重复性差：
   • 加样误差→采用自动化移液系统；
   • 模板降解→重复提取核酸并严格质控[[网页20]]。

结语

荧光定量PCR技术凭借其高精度高通量和灵活性，已成为分子生物学研究的核心工具。遵循标准化流程（如MIQE指南）并严格质控，可最大化数据的科学价值。未来随着微流控与数字PCR技术的融合，qPCR将在单细胞分析即时检测等领域展现更大潜力。