ELISA实验技术：原理方法与操作指南
ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种基于抗原-抗体特异性结合及酶催化显色反应的高灵敏度检测技术，广泛应用于医学诊断生物学研究食品安全和环境监测等领域。以下从原理类型步骤到注意事项进行全面解析。
一ELISA基本原理
ELISA的核心是将抗原或抗体固定于固相载体（如96孔聚苯乙烯板），通过酶标记物催化底物显色，实现目标分子的定性与定量分析。其优势包括：
- 高特异性：抗原-抗体结合精准识别目标物 1。
- 高灵敏度：可检测pg级微量物质 1。
- 定量能力：通过吸光度（OD值）与标准曲线计算浓度 18。
关键反应流程：
- 包被：抗原/抗体吸附于固相载体。
- 结合：待测样本与标记抗体/抗原特异性结合。
- 信号放大：酶（如辣根过氧化物酶HRP）催化底物（如TMB）显色。
- 检测：酶标仪测定OD值，颜色深度与目标物浓度成正比 1。
二ELISA主要类型及适用场景
根据检测策略，ELISA分为以下四类：
注：夹心法需确保两个抗体识别抗原的不同表位，避免空间位阻
18。
三标准操作流程
以间接法或夹心法为例，步骤包括：
-
样本制备
- 血清/血浆：避免溶血，离心后分装保存于-20°C（避免反复冻融） 18。
- 细胞上清：去除颗粒物，稀释高浓度蛋白（如BSA）以减少干扰 18。
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包被与封闭
- 包被：抗原/抗体稀释至1–10 μg/mL，加入孔板，4°C过夜或37°C孵育1–2小时。
- 封闭：加入牛血清白蛋白（BSA）或酪蛋白，覆盖未结合位点，减少非特异性结合 9。
-
加样与孵育
- 加入待测样本及标准品（复孔设置），37°C孵育1小时。
- 洗涤3–5次（缓冲液如PBS/TBST），去除未结合物。
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酶标记与显色
- 加入酶标抗体（如HRP标记二抗），37°C孵育1小时，再次洗涤 18。
- 加入底物（如TMB），避光反应15–30分钟，显色后立即加终止液（如硫酸） 18。
-
检测与数据分析
- 酶标仪读取OD值（常用450 nm，校正波长540/570 nm） 18。
- 绘制标准曲线（四参数逻辑拟合或对数回归），计算样本浓度 18。
四关键注意事项
- 样本处理：
- 细菌污染或溶血会导致假阳性；新鲜样本需及时检测。
- 试剂优化：
- 包被浓度抗体稀释度需预实验确定；避免试剂反复冻融 9 18。
- 洗涤控制：
- 充分洗涤降低背景，但避免孔壁干燥。
- 质量控制：
- 每板设阴性/阳性对照及空白孔，监控实验稳定性 18。
- 干扰因素：
- 复杂样本（如血清）需适当稀释，减少基质效应。
五应用领域
- 医学诊断：传染病抗体（HIV/乙肝）肿瘤标志物检测。
- 生物学研究：细胞因子激素定量分析 18。
- 食品安全：过敏原霉菌毒素及农药残留筛查。
- 环境监测：水体/土壤污染物（重金属有机毒素）检测。
六常见问题与解决方案
ELISA技术的可靠性依赖于严格的实验优化和规范化操作。未来发展中，与化学发光微流控等技术的结合将进一步拓展其高通量检测潜力。