配伍稳定性研究-微生物挑战

药品微生物挑战试验：评估防腐剂效力的关键研究

在药品开发与质量控制中，确保药品在整个货架期内的微生物安全性至关重要。对于含有防腐剂的多剂量注射剂、滴眼液、口服液等制剂，微生物挑战试验（也称为“防腐效力测试”）是评价其配方抵抗微生物污染、维持无菌状态能力的核心研究。该试验模拟药品在使用过程中可能遭受的微生物侵入挑战，验证其防腐体系的有效性。

一、 试验目的与核心原则

• 核心目的： 定量评估药品配方中防腐体系在模拟使用条件下，有效抑制或杀灭潜在污染微生物的能力，确保在多次使用间隔期内药品不被微生物污染繁殖，保障患者用药安全。
• 核心原则： 在受控的实验室条件下，将规定浓度和数量的特定微生物接种到待测药品样品中，在指定的温度下储存，并在预设的时间点取样检测样品中存活的微生物数量。通过分析微生物数量随时间的变化趋势，判断防腐效力是否符合法定标准。

二、 试验设计与关键要素

1. 测试菌株的选择：

   • 代表性： 选择法规（如各国药典、ICH指南）要求且与药品潜在污染风险密切相关的标准菌株。通常包括：
     • 细菌： 革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）、革兰氏阴性菌（如铜绿假单胞菌、大肠埃希菌）。
     • 酵母菌： 白色念珠菌。
     • 霉菌： 黑曲霉。
   • 依据： 菌株应能代表药品在生产、使用过程中可能遭遇的常见污染微生物类型，并具有相当的挑战性。
   • 来源与状态： 使用标准菌种保藏中心获取的菌株，传代次数需严格控制（通常不超过五代）。使用前需进行纯度和特性确认。试验时使用新鲜的、处于对数生长期的培养物以确保活性。

2. 接种物的制备与接种：

   • 制备： 将各测试菌株分别在适宜的液体培养基（如胰酪大豆胨液体培养基）中培养至对数生长期，离心洗涤并用无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液重悬，调整至所需的浓度（通常约10⁶到10⁸ CFU/mL）。
   • 接种：
     • 接种量通常为样品总体积的0.1%-1%，目标是将样品中的微生物初始浓度控制在约10⁵到10⁶ CFU/mL范围。
     • 接种操作需无菌、快速、混合均匀。整个过程需进行微生物计数验证实际接种浓度。

3. 中和剂验证（Critical）：

   • 目的： 确保取样后能立即、完全地中止样品中残留防腐剂的杀菌或抑菌作用，避免其对后续微生物计数的干扰，使检测结果真实反映取样时点样品中存活的微生物数量。
   • 方法：
     • 中和效力试验： 确认中和剂能在规定时间内完全中和防腐剂作用。
     • 毒性试验： 确认中和剂及其浓度不影响被测微生物的复苏和生长。
     • 生长恢复试验： 确认中和后的样品中，低浓度的残留微生物能在适宜培养基上正常生长繁殖以便准确计数。
   • 常见中和剂/方法： 稀释法、化学中和剂（如卵磷脂、吐温80、硫代硫酸钠、组氨酸等）、膜过滤法（结合充分冲洗）、特定酶（如青霉素酶）等。选择取决于防腐剂类型。

4. 样品准备与分组：

   • 取足够数量的同一批次药品样品。
   • 设立：
     • 测试组： 接种各测试菌株的样品。
     • 阳性对照组： 接种菌株到无菌稀释液或无防腐剂基质中（验证微生物存活能力）。
     • 阴性对照组： 不接种菌株的样品（确认无菌操作及样品初始无菌状态）。
     • (可选) 防腐剂效力对照组： 接种菌株到已知防腐效力合格的对照品中。
   • 所有样品在接种后立即置于规定的储存温度（通常为20-25°C）下避光保存。

5. 取样时间点设定：

   • 根据药品类型和预期使用周期，在关键时间点取样检测微生物存活数量。
   • 典型时间点（小时/天）： 接种后即刻（0时）、6小时、24小时、48小时、7天、14天、21天、28天。
   • 目的： 捕捉微生物数量动态变化（初期快速杀灭、持续抑制、潜在复苏等）。

6. 微生物计数：

   • 在各预定时间点，无菌吸取适量测试组样品。
   • 立即加入足量、有效的中和剂/进行中和操作。
   • 采用适宜的微生物计数方法（通常是平板计数法（倾注法或涂布法））进行活菌计数。
   • 使用合适的培养基和培养条件（温度、时间）确保目标微生物生长良好（如胰酪大豆胨琼脂培养细菌，沙氏葡萄糖琼脂培养真菌）。
   • 结果以菌落形成单位每毫升（CFU/mL）报告。

三、 数据分析与结果判定

1. 数据处理：

   • 计算各时间点各测试菌株的活菌浓度（log₁₀ CFU/mL）。
   • 计算相对于初始接种浓度（0时）的活菌数下降值（log₁₀ 减少值）（即 lg N₀ - lg Nₜ）。
   • 绘制各菌株的存活曲线（活菌浓度的对数 vs. 时间）。

2. 判定标准（主要参考各国药典）：

   • 常用标准（例如USP <51>, EP 5.1.3, JP）对非无菌口服制剂、非无菌粘膜用制剂（滴眼/鼻/耳）、多剂量注射剂等有不同要求。判定通常考察在特定时间点（如第7天、14天、28天）需达到的最低对数减少值和对后续时间点的维持要求。
   • 示例性判定要求（非绝对，具体需依据法规）：
     • 细菌（如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌）：
       • 14天：活菌数下降 ≥ 3.0 log （即减少至初始的0.1%以下）。
       • 28天：活菌数下降 ≥ 3.0 log，且不得高于14天时的水平。
     • 酵母菌/霉菌（如白色念珠菌、黑曲霉）：
       • 14天及28天：活菌数下降 ≥ 2.0 log （即减少至初始的1%以下）或不得高于初始接种量。
       • 且在试验期间不得出现持续的增长趋势。
   • 达标要求： 所有规定的测试菌株必须同时满足相应标准，试验方被视为通过。

四、 影响试验结果的关键因素与注意事项

1. 样品均匀性： 确保药品成分（尤其是防腐剂）分布均匀，接种后混合充分。
2. 防腐剂降解： 长期试验中需关注防腐剂自身的稳定性，其降解可能导致后期效力不足。
3. 容器密闭系统： 容器的材质、密封性、顶空大小可能影响防腐剂活性或导致水分损失。
4. 微生物状态与适应性： 使用标准化、健康的菌株。需警惕微生物可能对防腐剂产生的适应性或耐受性。
5. 中和剂有效性： 中和失败将导致结果严重偏差（假阴性，低估存活菌数），是试验最关键环节之一。
6. 培养条件： 必须确保计数方法能有效复苏和检测可能受损伤但未死亡的微生物。
7. 试验条件控制： 温度、光照等储存条件需严格控制。

五、 法规意义与应用

微生物挑战试验是药品（尤其是多剂量制剂）注册申报资料中的重要组成部分，是证明其防腐体系有效性的直接证据。其结果是确定药品货架期、使用期限（开封后使用期限）以及制定合理使用说明（如“避免污染”）的重要科学依据。各国药品监管机构均高度重视该试验的规范性、科学性和数据的可靠性。

六、 结论

微生物挑战试验是一项严谨、精密的研究，要求精确控制微生物状态、接种水平、中和有效性、培养条件以及实验操作。通过系统地模拟实际使用中的污染风险并对微生物存活进行定量监测，该试验为评估药品防腐剂效力、保障多剂量制剂在反复使用过程中的微生物安全性提供了核心科学数据。严格遵循药典方法和良好实验室规范是获得可靠结果、确保用药安全的前提。