无菌检查

发布时间：2025-06-21 08:52:31 阅读量：2 作者：生物检测中心
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无菌检查：药品与医疗器械安全保障的核心环节

无菌检查是药品（尤其是注射剂、眼用制剂、植入剂等）和医疗器械（如植入物、手术器械包、一次性输液器具）质量控制中至关重要的检测项目。其核心目的是确认受检样品中是否含有活的微生物，确保产品达到“无菌”状态，从而保障患者使用安全，防止因微生物污染导致的感染、败血症等严重后果。这是一项基于严格科学程序和法规要求的破坏性试验。

核心原理： 将被检样品或其代表性部分，在无菌环境下，按照既定规程接种至适宜的培养基中，并在规定的温度和时间下培养。若培养基中无微生物生长，则判为符合无菌要求；若有微生物生长，则判为不符合无菌要求。

关键步骤与要素：

  1. 环境控制：

    • 无菌操作区： 试验必须在B级背景下的A级单向流空气区域（如超净工作台、隔离器）内进行。环境需通过悬浮粒子、沉降菌/浮游菌、表面微生物等监测，并定期验证，确保达到无菌操作要求。
    • 人员操作： 操作人员需经过严格无菌操作技术培训，穿戴无菌洁净服，最大限度减少操作引入污染的风险。

  2. 培养基：

    • 种类：
      • 硫乙醇酸盐流体培养基 (FTM)： 主要用于厌氧菌和需氧菌的培养，特别是梭菌等厌氧菌。培养时需保证上层有氧、下层无氧的环境。
      • 胰酪大豆胨液体培养基 (TSB)： 主要用于需氧菌和真菌的培养。
    • 适宜性检查：
      • 无菌性： 每批培养基在使用前必须进行无菌检查，确保其本身无菌。
      • 灵敏度： 培养基必须能支持数量较少的试验菌株生长。定期使用代表菌种（如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉）进行灵敏度试验，验证其促生长能力。

  3. 方法与样品处理：

    • 方法选择： 依据产品特性选择最合适的方法：
      • 薄膜过滤法： 最常用和最可靠的方法，尤其适用于可溶于水或油性液体、抗生素、大容量样品。将规定量的样品通过孔径≤0.45µm的除菌级滤膜过滤，微生物被截留在滤膜上。然后用无菌的冲洗液（常含中和剂如聚山梨酯80、卵磷脂等用于中和防腐抑菌成分）充分冲洗滤膜以去除可能的抑菌残留物，最后将滤膜转移至培养基中或直接将培养基加入滤器内。
      • 直接接种法： 直接将规定量的样品等份接种至两种培养基中。适用于无法过滤的样品（如油剂、软膏、无菌粉末、医疗器械等），或小容量注射剂。需特别注意样品量及其可能存在的抑菌性，必要时增加培养基体积或使用中和剂。
    • 供试品数量与检验量： 具体数量及检验量需严格按照现行有效的《中华人民共和国药典》（ChP）或其它适用法规（如USP, EP）的要求执行。
    • 抑菌性处理： 若样品本身具有抑菌性（如含防腐剂、抗生素），必须采用有效方法消除其干扰，常用方法包括：
      • 使用足够量的冲洗液多次冲洗滤膜（薄膜过滤法）。
      • 在培养基中加入适当中和剂（如聚山梨酯80、卵磷脂、β-内酰胺酶等）。
      • 增大培养基稀释倍数（直接接种法）。

  4. 培养与观察：

    • 培养条件：
      • FTM 管： 在30-35℃下培养不少于14天。
      • TSB 管： 在20-25℃下培养不少于14天。
    • 观察： 在整个培养期间，需定期（通常在培养的第3、5、7、14天或按药典规定）观察所有培养基是否有微生物生长迹象（如浑浊、沉淀、菌膜、产气等）。观察应在良好照明条件下进行。

  5. 阳性对照与阴性对照：

    • 阴性对照： 取相应体积的稀释液和/或冲洗液，进行与方法相同的过滤或接种操作，培养后应无菌生长。用于证明试验用稀释液、冲洗液、设备和操作过程的无菌性。
    • 阳性对照： 在试验中或试验结束时，取少量灵敏度试验所用的菌液（通常含菌量<100 CFU），加入相应的培养基管中，置规定条件下培养，应在24-72小时内呈现明显生长。用于证明培养基的促生长能力在试验条件下未受影响。阳性对照试验必须在专门的阳性对照实验室进行，严格防止污染检测样品。

  6. 结果判读：

    • 符合无菌检查要求： 所有供试品容器中的培养基在整个培养期间均澄清、无可见微生物生长，且阳性对照管显示生长良好，阴性对照管无菌生长。
    • 不符合无菌检查要求： 任何供试品容器中的培养基在培养期间呈现可见微生物生长（经确认非污染所致），且该生长经确证试验证实为微生物生长。
    • 试验无效： 若试验过程中存在明显的无菌操作失误或环境监控结果超标，或阴性对照管呈现微生物生长，或阳性对照管未呈现生长，则本次试验无效，需查明原因后重试。

  7. 复验与调查：

    • 如果供试品管呈现微生物生长（初试不合格），需谨慎评估是否进行复验。复验通常只在有充分证据证明初试结果无效（如明确的操作失误、环境失控、培养基问题）时才可进行。
    • 一旦确认样品无菌检查不合格，必须启动彻底的偏差调查（OOS），追溯生产过程、环境监控记录、灭菌验证数据、实验室操作等环节，查找根本原因并采取纠正预防措施（CAPA）。

关键挑战与注意事项：

  • 假阴性风险： 样品抑菌性未彻底消除，导致样品中存在的微生物不能生长而被漏检。充分的灵敏度试验和有效的去除抑菌性措施至关重要。
  • 假阳性风险： 实验操作或环境引入污染导致的错误结果。严格的环境控制、规范的无菌操作技术和有效的阴性对照是核心保障。
  • 样品的代表性： 取样方法和样品量必须能代表整批产品的无菌状态。
  • 法规符合性： 无菌检查全过程必须严格遵循《中国药典》或其他强制执行的国际/国家药典标准以及GMP/GSP等法规要求。
  • 人员素质： 操作人员的技术熟练度、无菌意识和责任心对结果可靠性影响极大。

无菌检查发展趋势： 随着技术进步，隔离器技术的广泛应用显著降低了环境因素导致的假阳性风险。快速微生物检测方法（如基于ATP生物发光、流式细胞术、核酸扩增技术等）的研究和应用正在快速发展，有望在保证可靠性的前提下，大幅缩短无菌检查的周期。

总结： 无菌检查是保障最终灭菌产品或无菌生产工艺产品安全性的最后一道重要关卡。它是高度严谨、受严格法规约束的生物学检测过程。其有效性依赖于完备的设备设施、充分验证的方法、合格的人员、严格的环境控制以及科学的结果判读和调查体系。严格遵守操作规程和药典标准，是确保无菌检查结果可靠、进而保障患者用药用械安全的根本所在。