茉莉酸（JA）检测 - 中析研究所生物检测中心

茉莉酸（JA）检测：方法与应用详解

茉莉酸（Jasmonic Acid, JA）及其衍生物（统称为茉莉酸类化合物，JAs）是植物体内至关重要的脂质衍生信号分子，在植物生长发育、抗逆防御（抵抗病虫害、干旱、盐碱等）、伤害响应以及次级代谢产物合成等众多生理过程中扮演着核心调控角色。精确检测植物组织中JA的含量及其动态变化，对于深入解析植物的信号转导机制、抗性机理以及开发利用植物天然产物具有重大科学意义。以下系统介绍当前主流的JA检测方法及其关键要点：

一、样品前处理：质量保障的基石

样品采集与淬灭：
- 快速冷冻： 最常用方法。新鲜植物组织（如叶片、根、花、果实）采集后立即投入到液氮中快速冷冻，瞬间终止酶活，防止JA的合成、降解或转化。
- 低温保存： 液氮速冻后的样品转移至超低温冰箱（-80℃）长期保存，避免反复冻融。
- 冷冻干燥（可选）： 对于部分后续提取流程或需要长期稳定保存样品，可进行冷冻干燥（冻干）。
组织研磨与均质：
- 在液氮预冷的研钵或专用球磨仪中将冷冻的组织研磨成细粉，保证组织充分破碎，利于溶剂渗透。
目标化合物提取：
- 常用溶剂： 预冷的酸性有机溶剂体系应用最广。
  - 甲醇/水/甲酸 (80:19.9:0.1, v/v/v)： 高效提取JA及其多种衍生物（如茉莉酸-异亮氨酸复合物 JA-Ile），酸性条件抑制降解并帮助质子化酸性化合物。
  - 乙腈/水/甲酸 (80:19.9:0.1, v/v/v)： 有时作为甲醇的替代品，尤其适用于后续LC-MS分析。
- 操作要点：
  - 按比例加入预冷的提取溶剂（如10-20 mg组织粉末 / 1 mL溶剂）。
  - 剧烈涡旋混匀。
  - 在低温（4℃）下振荡提取（如30-60分钟）。
  - 低温高速离心（如4℃，15000-20000 g，15-20分钟）沉淀残渣。
  - 小心收集上清液（即提取液）。
提取液净化与浓缩：
- 目的： 去除色素、脂质、糖类、蛋白质等干扰物质，提高检测灵敏度和选择性，浓缩目标物。
- 常用方法：
  - 固相萃取： 最常用且高效。
    - 柱填料： 反相C18柱适用于大多数JAs；混合模式阴离子交换柱（如Oasis MAX, HLB等）可特异性吸附酸性化合物，净化效果更佳。
    - 流程： 活化 -> 平衡 -> 上样（提取液） -> 洗杂 -> 洗脱（使用含酸的甲醇、乙腈或丙酮洗脱目标JAs）。
  - 液液萃取： 传统方法。将提取液用有机溶剂（如乙酸乙酯、二氯甲烷）在酸性条件下进行多次萃取，合并有机相后浓缩。
- 浓缩： 洗脱液或萃取得到的有机相通常需要用温和的氮气吹扫或真空离心浓缩仪去除大部分溶剂，最后用少量适合后续分析的溶剂（如初始LC流动相）复溶。全程低温操作，避光，避免过度干燥导致目标物损失。

二、主要检测方法

高效液相色谱法（HPLC）：
- 原理： 基于JA在固定相和流动相中的分配系数差异进行分离。
- 检测器：
  - 紫外/可见光检测器（UV/Vis）： JAs在200-220 nm左右有弱紫外吸收。灵敏度较低，特异性差，易受复杂基质中其他共洗脱化合物的干扰。通常仅适用于浓度较高的样品或作为初步筛选手段。
  - 荧光检测器（FLD）： JA本身无荧光，需要衍生化。常用衍生化试剂如9-蒽基重氮甲烷（ADAM）或丹磺酰肼（Dns-Hydrazine），生成具有强荧光的衍生物后进行检测。灵敏度优于UV，但仍可能受衍生效率和副产物影响。
- 特点： 设备普及，运行成本相对较低。但灵敏度、特异性在复杂植物基质中对JA的准确定量有限。
气相色谱-质谱联用法（GC-MS）：
- 原理： JA需先进行衍生化（提高挥发性和热稳定性，改善峰形）。
  - 常用衍生化试剂： 重氮甲烷（生成甲酯）、N-甲基-N-(叔丁基二甲基硅基)三氟乙酰胺（MTBSTFA，生成叔丁基二甲基硅基衍生物）、N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺（BSTFA，生成三甲基硅基衍生物）。
- 分离： 气相色谱柱（如HP-5MS, DB-5MS等非极性/弱极性柱）分离衍生化后的JA酯。
- 检测：
  - 电子轰击电离（EI）： 获得丰富的特征碎片离子谱图，可与标准品谱库比对进行定性确认。
  - 选择离子监测（SIM）： 选择JA衍生物的特征离子（如分子离子或1-2个丰度高的特征碎片离子）进行监测，显著提高灵敏度和选择性。
- 特点： 灵敏度高、特异性好、可定性定量，是JA检测的经典方法。缺点是前处理步骤多（需衍生化），耗时较长，且不适合分析热不稳定的复杂衍生物（如JA-Ile）。
液相色谱-质谱联用法（LC-MS / LC-MS/MS）：
- 当前JA检测的黄金标准和技术主流。
- 分离： 反相高效液相色谱柱（如C18，C8柱）分离目标物。流动相通常为水/甲醇或水/乙腈体系，添加少量甲酸（如0.1%）或乙酸铵（如5-10 mM）调节pH和促进电离。
- 检测：
  - 质谱离子源：
    - 电喷雾电离（ESI）： 最常用，特别适合JA这类极性、可离子化的化合物。JA在负离子模式（ESI-）下易形成去质子化分子[M-H]⁻。JA-Ile也常在ESI-下检测。
  - 质量分析器：
    - 三重四极杆质谱（QQQ或QqQ）： 首选用于高灵敏度、高特异性定量分析。 采用多反应监测（MRM）模式：第一个四极杆选择母离子（如JA的[M-H]⁻，m/z 209），碰撞室中碎裂，第二个四极杆选择特定的、丰度高的子离子（如JA常见的子离子m/z 59, 165）进行检测。通过优化碰撞能量获得最佳响应。MRM模式能有效排除基质干扰。
    - 高分辨质谱（HRMS）： 如四极杆-飞行时间（Q-TOF）、Orbitrap等。提供精确母离子和子离子质量数（通常优于5 ppm精度），可推断分子式，增强定性的确定性，尤其适用于非靶向分析和未知代谢物鉴定。可采用目标离子监测（SIM）或数据依赖采集（DDA）/数据非依赖采集（DIA）模式。
- 特点：
  - 无需衍生化，简化前处理。
  - 超高灵敏度和特异性（尤其MRM模式）。
  - 宽动态范围，适合痕量到高浓度分析。
  - 兼容多种茉莉酸类化合物（JA、茉莉酸甲酯MeJA、JA-Ile、羟基茉莉酸OH-JA等）在同一方法中同时检测。
  - 设备成本和维护要求较高。
免疫分析法（酶联免疫吸附试验 - ELISA）：
- 原理： 利用针对JA（或特定衍生物如JA-Ile）的特异性抗体进行抗原-抗体结合反应。
- 类型：
  - 间接竞争ELISA： 样品中的游离JA与固定在板上的JA类似物（如JA与载体蛋白的偶联物）竞争结合限量抗体。随后加入酶标二抗显色，吸光度与样品中JA浓度成反比。需注意交叉反应（特异性）。
- 特点：
  - 设备简单（酶标仪），高通量，成本较低。
  - 适用于大批量样品的快速筛查。
  - 灵敏度可达nmol/g FW级，通常低于LC-MS/MS。
  - 抗体特异性是关键局限：不同来源抗体对JA类似物（如MeJA, OPDA）的交叉反应性差异大，可能导致假阳性或低估/高估。需要验证抗体的特异性。
  - 前处理要求相对较低，但仍需适当净化以排除基质干扰抗体反应。

三、方法选择与要点总结

关键要点与注意事项：

内标法定量： 所有定量方法都强烈推荐使用稳定同位素标记的内标（如[13C6]-JA, [D6]-JA, [13C6]-JA-Ile等）。内标应在样品提取前或提取早期加入，用于校正提取、净化、浓缩和仪器分析过程中的目标物损失和基质效应。这是获得准确定量的基石。
方法验证： 建立检测方法后，必须进行严格验证，包括：
- 线性范围： 评估方法在预期浓度范围内的线性响应。
- 检出限（LOD）与定量限（LOQ）： 确定方法能够可靠检测和定量的最低浓度。
- 精密度： 考察重复性（同批内）和重现性（不同批次间）。
- 准确度： 可通过加标回收率实验评估（通常要求回收率在70-120%之间，RSD < 15-20%）。
- 基质效应： 评估共提取物对目标物离子化效率的影响（LC-MS/MS尤为重要）。可通过比较标准品在纯溶剂和基质提取液中的响应差异来评估。优化前处理和色谱分离是减轻基质效应的关键。
基质效应： 植物提取物成分复杂，可能抑制或增强目标物在质谱中的离子化效率（尤其在ESI源中）。可通过以下策略缓解：
- 优化样品前处理（净化）： 提高选择性。
- 优化色谱分离： 让目标物与主要干扰物在色谱上分开。
- 使用同位素内标： 内标与目标物经历相同的基质效应，是校正基质效应最有效的方法。
- 稀释样品： 如果灵敏度允许。
- 标准加入法： 操作繁琐，但有时有效。
选择合适的JA形式： 茉莉酸信号转导中，JA-Ile被广泛认为是主要生物活性形式，通过SCFCOI1-JAZ共受体感知。因此，在研究与信号转导直接相关的生理过程（如诱导防御基因表达）时，检测JA-Ile通常比检测游离JA更具生物学意义。方法选择需考虑目标分析物（游离JA、MeJA、JA-Ile、OPDA等）。

结论：

茉莉酸的高灵敏度、高特异性检测是深入了解植物茉莉酸信号通路及其生理功能的关键技术支撑。随着分析技术的发展，LC-MS/MS（特别是三重四极杆质谱的MRM模式）凭借其卓越的灵敏度、特异性、无需衍生化和多组分同时分析能力，已成为当前JA定量研究的首选方法。GC-MS作为经典方法仍有其价值。ELISA则在高通量筛选方面具有优势，但对抗体特异性的依赖性是其应用的限制因素。无论选择哪种方法，严谨的样品前处理（尤其是快速淬灭和有效净化）、使用稳定同位素内标进行准确定量以及严格的方法验证，都是获得可靠、可重复数据的必备条件。研究者需要根据自身的研究目标（目标化合物、灵敏度要求、通量需求、预算、实验室设备条件）权衡利弊，选择最合适的检测策略。