细菌、放线菌、酵母、霉菌检测

发布时间：2025-06-20 11:26:02 阅读量：2 作者：生物检测中心

四大类微生物标准检测技术指南：细菌、放线菌、酵母、霉菌

本指南详细介绍食品、药品、化妆品、环境等领域中常见的四大类微生物（细菌、放线菌、酵母、霉菌）的标准检测方法和技术要点，旨在为实验室检测工作提供规范参考。

一、 样品采集与前处理

  • 无菌操作： 全程在洁净环境或无菌操作台中进行，使用灭菌器具。
  • 代表性取样： 确保样品能准确反映整体状态。
  • 均质化： 固体或半固体样品需加入适量无菌稀释液（如0.85%生理盐水、磷酸盐缓冲液），使用无菌均质袋或均质器充分均质。
  • 稀释： 制备一系列10倍梯度稀释液（如10⁻¹, 10⁻², 10⁻³…），用于后续计数。

二、 细菌检测 (Bacteria Detection)

  • 原理： 利用富含营养的培养基，在适宜温度下培养，使样品中的细菌生长繁殖形成肉眼可见的菌落，通过计数计算样品中的细菌数量（菌落形成单位，CFU）。
  • 常用培养基：
    • 平板计数琼脂 (Plate Count Agar, PCA)： 常规需氧菌总数计数通用培养基。
    • 营养琼脂 (Nutrient Agar, NA)： 基础通用培养基。
    • 特定培养基： 如检测大肠菌群用月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 (LST) 和煌绿乳糖胆盐肉汤 (BGLB)；检测金黄色葡萄球菌用Baird-Parker琼脂；检测沙门氏菌用选择性增菌液和显色/选择性平板等。
  • 方法步骤：
    1. 倾注平板法： 取适宜稀释度的样品匀液1 mL加入无菌平皿中，倾注约15-20 mL 冷却至45-50℃的熔化PCA或NA培养基，立即混匀。
    2. 涂布平板法： 取0.1 mL适宜稀释度的样品匀液，滴加至已凝固的PCA或NA平板上，用无菌涂布棒均匀涂布。
    3. 培养： 倒置平板，置于恒温培养箱中，通常需氧细菌培养温度为30-35℃或特定温度（如37℃），培养48 ± 2小时（某些特定菌或方法时间不同）。
    4. 计数： 选择菌落数在30-300 CFU之间的平板进行计数。低于30 CFU的平板记录具体菌落数，大于300 CFU的记为“多不可计”（TMTC）。计算每克或每毫升样品中的细菌总数。
  • 结果报告： 报告为 CFU/g、CFU/mL 或 CFU/cm² 等。

三、 放线菌检测 (Actinomycetes Detection)

  • 特性： 革兰氏阳性，好氧或兼性厌氧，菌落干燥、紧密、常有褶皱，常产生土壤气味（土腥味）。生长较细菌缓慢。
  • 常用培养基：
    • 高氏一号合成琼脂 (Gauze’s Synthetic Agar No.1)： 无机盐淀粉培养基，抑制细菌和真菌效果较好，常用于土壤等样品中放线菌分离计数。
    • 淀粉酪素琼脂 (Starch Casein Agar)： 富含淀粉和多肽，利于放线菌生长。
    • 改良燕麦片琼脂 (Modified Oatmeal Agar)： 也常用于放线菌分离。
  • 方法步骤：
    1. 样品前处理 (选择性)： 为减少细菌和真菌干扰，样品匀液可进行预处理。常用方法包括：
      • 风干处理： 样品自然风干几小时至数天。
      • 加热处理： 样品匀液60℃水浴加热10分钟（杀死部分细菌和营养体真菌）。
      • 化学抑制剂： 在培养基中加入抑菌剂（如重铬酸钾，浓度需精确控制且通常需要预处理后洗涤）。
    2. 接种： 一般采用涂布平板法（0.1 mL）或倾注平板法（1 mL）。涂布法更常用，便于观察典型菌落形态。
    3. 培养： 倒置平板，通常置于恒温培养箱中25-30℃培养。放线菌生长缓慢，通常需要培养5-10天，甚至14天才能充分生长并形成特征性菌落。
    4. 计数与鉴定： 观察典型放线菌菌落（表面干燥、粉状、有褶皱、深入培养基、常产生色素）。有时需要显微镜观察（分枝丝状体结构）或简单染色确认。计数方法同细菌。
  • 结果报告： 报告为 CFU/g 或 CFU/mL。需注明培养温度和时间。

四、 酵母和霉菌检测 (Yeast and Mold Detection)

  • 特性： 真核微生物。酵母菌落通常光滑、湿润、不透明、乳白色或奶油色，类似细菌但较大；霉菌菌落呈绒毛状、棉絮状、网状或粉末状，常有丰富颜色（孢子颜色）。两者生长均较细菌慢。
  • 常用培养基：
    • 马铃薯葡萄糖琼脂 (Potato Dextrose Agar, PDA)： 广泛用于真菌培养。
    • 玫瑰红钠琼脂 (Rose Bengal Agar)： 选择性培养基，玫瑰红钠抑制细菌生长和霉菌菌落蔓延（限制其快速生长便于分离单菌落），琼脂中所含的氯霉素或金霉素/氯霉素可抑制大多数细菌。
    • 酵母提取物麦芽汁琼脂 (Yeast Extract Malt Extract Agar, YM Agar)： 促进酵母生长。
  • 方法步骤：
    1. 接种： 通常采用涂布平板法（0.1 mL）或倾注平板法（1 mL）。
    2. 培养： 倒置平板，置于恒温培养箱中培养。霉菌和酵母最适温度通常在20-25℃或25-28℃。霉菌易蔓延生长，培养时间通常需要5天，甚至7天，以确保生长缓慢的霉菌也能形成可见菌落。
    3. 计数：
      • 霉菌： 计数具有典型霉菌形态特征的菌落（丝状结构）。若单个菌落生长蔓延覆盖大片区域，应视为一个菌落计数；若有多个生长点，则应视为多个菌落计数。
      • 酵母： 计数具有典型酵母形态特征的菌落（光滑、湿润、乳白色）。有时在同一平板上酵母和霉菌均存在，应分别报告。
    4. 鉴定 (必要时)： 根据菌落形态（大小、质地、颜色、边缘）、显微镜观察（酵母细胞形态、出芽情况；霉菌菌丝、孢子结构）进行初步鉴别。
  • 结果报告： 报告为 酵母和霉菌总数 (Yeast and Mold Count, YMC) 或分别报告酵母数和霉菌数，单位为 CFU/g 或 CFU/mL。需注明培养温度和时间（至少5天）。

五、 结果报告与质量控制

  • 报告内容： 清晰标明检测项目（如菌落总数、霉菌和酵母总数、特定菌计数）、样品信息、检测方法依据、最终结果（CFU/g, CFU/mL等）、培养条件（温度、时间）、报告日期、检测人员等。
  • 质量控制：
    • 空白对照： 每批次实验需设置稀释液/培养基的空白对照平板（接种无菌稀释液），应无菌生长。
    • 阳性对照： 定期使用标准菌株验证培养基和方法的有效性（如大肠埃希氏菌验证PCA，黑曲霉验证PDA/RBA）。
    • 平行试验： 重要样品或仲裁检测时，应做平行样品检测。
    • 培养基质控： 新批次或储存的培养基使用前需进行无菌性检查和生长能力检查（促生长能力）。
    • 环境监控： 定期对实验室环境（特别是无菌操作区域）进行沉降菌或接触碟监测。

六、 重要注意事项

  1. 无菌操作： 贯穿整个实验过程的核心要求。
  2. 稀释准确性： 确保逐梯度准确稀释，混匀充分。
  3. 培养基温度： 倾注平板时，培养基温度务必降至45-50℃，避免烫死微生物。
  4. 培养时间与温度： 严格遵守各方法规定的培养温度和时间，特别是放线菌和霉菌需要较长时间。
  5. 菌落识别： 准确识别不同微生物的菌落特征是获得可靠结果的关键。对不典型或难以鉴别的菌落需进一步镜检确认。
  6. 设备校准： 定期对培养箱、天平、移液器、温度计等关键设备进行校准。
  7. 生物安全： 操作潜在致病性微生物或在处理未知样品时，应遵守相应级别的生物安全规范，在生物安全柜内操作，做好个人防护（实验服、手套、口罩/面罩、必要时护目镜），废弃物按规定高压灭菌处理。

七、 总结

细菌、放线菌、酵母和霉菌的有效检测依赖于标准化的操作流程、合适的培养基选择、严格的培养条件控制以及对菌落形态的准确识别。始终将无菌操作和质量控制贯穿于检测全过程，是确保结果准确、可靠的基础。本指南提供的方法是基于传统培养法的通用标准流程，实际应用中应根据具体样品特性、行业标准和检测目的选择最适合的方案并进行必要的验证。