石蕊牛乳试验

石蕊牛乳试验：微生物代谢活动的经典指示剂

石蕊牛乳试验（Litmus Milk Test）是微生物学中一项历史悠久且功能强大的生化试验，主要用于评估微生物对各种牛乳成分（尤其是乳糖和酪蛋白）的代谢能力及其产生的酸碱变化。它通过观察牛乳培养基发生的物理和化学变化，为鉴定细菌（特别是乳酸菌、梭菌属、肠杆菌科细菌等）提供关键信息。

一、 试验原理

该试验基于两个核心反应：

1. 酸碱指示作用（石蕊）：

   • 石蕊是一种天然酸碱指示剂，在中性环境（如新鲜牛乳）呈淡紫色。
   • 产酸反应： 若微生物发酵乳糖产酸 (如乳酸、乙酸)，培养基pH下降，石蕊变 红色 (酸性)。
   • 产碱反应： 若微生物分解酪蛋白产生碱性胺类物质（如色氨酸分解产生吲哚，进一步形成碱性物质），培养基pH上升，石蕊变 深蓝色 (碱性)。
   • 还原作用： 某些微生物具有强还原能力，能将石蕊还原脱色，导致培养基底部或整体呈现 白色或浅黄色（尤其在厌氧条件下常见）。

2. 酪蛋白凝固与消化（凝乳酶与蛋白酶）：

   • 酸凝固： 乳糖发酵产酸达到足够浓度（pH约4.6）时，酪蛋白等电点被触及，发生不可逆的 凝固，形成坚实的凝块。即使振荡也不会分散。
   • 酶凝固（凝乳酶样作用）： 少数微生物（如某些乳酸菌）能产生类似凝乳酶的酶，在接近中性pH下缓慢凝固酪蛋白，产生的凝块通常较软，振荡可能部分破碎。
   • 消化（胨化或蛋白水解）： 微生物分泌胞外蛋白酶（如胰蛋白酶样酶），将凝固的或未凝固的酪蛋白逐步分解成可溶性多肽和氨基酸。这导致：
     • 原先存在的凝块被 溶解（消化）。
     • 培养基变得 澄清、半透明或透明（有时呈黄褐色）。
     • 消化过程通常会产生碱性产物，常伴随石蕊变 蓝色。消化可能从凝块顶部开始向下发展，或从底部开始向上发展（称为“漏斗状消化”或“风暴式消化”），也可能均匀进行。

二、 培养基组成

• 基础成分：
  • 脱脂奶粉：提供乳糖、酪蛋白、乳清蛋白、矿物质、维生素等牛乳主要营养成分。使用脱脂奶粉可避免脂肪干扰观察。
  • 蒸馏水：溶解奶粉。
• 指示剂：
  • 石蕊溶液：通常按一定比例（如0.5%终浓度）加入，作为pH指示剂和氧化还原指示剂。
• 最终特性：
  • 经过灭菌（常用间歇灭菌或高压灭菌）后，新鲜培养基呈均质的淡紫色悬液（中性）。
  • 灭菌过程可能导致少量石蕊被还原，试管底部有时可见少量白色沉淀（还原区），此为正常现象。

三、 试验步骤

1. 接种： 用纯培养的待测微生物新鲜菌落或菌液接种石蕊牛乳培养基。
2. 培养： 根据待测菌的特性，在适宜温度（通常35-37°C）下进行需氧或厌氧培养。
3. 观察：
   • 频率： 需定期观察，通常在培养 24小时、48小时、5-7天甚至更长时间 后进行，尤其是观察缓慢发生的消化作用。
   • 观察要点：
     • 颜色变化： 整个培养基的颜色（紫色、红色、蓝色、白色）。
     • 凝固： 是否形成凝块？凝块的质地（坚硬、柔软）？位置？
     • 消化： 培养基是否变得澄清？凝块是否被部分或完全溶解？消化的方式和范围（如顶部、底部、均匀）？
     • 气体： 是否产气？气体可能导致凝块破碎或形成多孔结构（“风暴式发酵”），或使培养基产生裂隙。
     • 还原： 培养基底部或整体是否褪色（变白或变黄）？

四、 结果判读（常见反应模式及微生物举例）

对培养基发生的多种变化进行综合判断：

1. 不变：

   • 培养基保持淡紫色，无凝固，无消化。表示微生物不能利用乳糖或酪蛋白，也未显著改变pH或还原石蕊（如某些不发酵糖的微球菌、部分芽胞杆菌）。

2. 产酸 (Acid)：

   • 石蕊变红，无凝固。表明微生物发酵乳糖产酸，但酸度尚不足以凝固酪蛋白（产酸量较低）。

3. 酸凝固 (Acid Curd)：

   • 石蕊变红，培养基凝固成坚实的凝块（通常占据大部分培养基）。这是乳糖发酵产酸（主要是乳酸）使酪蛋白等电点沉淀的典型结果。常见于 乳酸杆菌属、链球菌属、乳球菌属 等乳酸菌。

4. 还原 (Reduction)：

   • 石蕊褪色，培养基变为白色、黄白色或浅黄色（通常在底部或厌氧区更明显）。表示微生物还原了石蕊。常伴随其他反应（如酸凝固或消化）。
   • 强还原性厌氧菌如 梭菌属 细菌常导致剧烈还原。

5. 产碱 (Alkaline)：

   • 石蕊变深蓝色。表明微生物利用含氮物质（主要是酪蛋白）产生碱性代谢产物。假单胞菌属、产碱杆菌属 细菌常见此反应。

6. 消化 (Peptonization / Proteolysis)：

   • 伴随碱性的消化：
     • 碱性消化： 石蕊变蓝，凝固的凝块被消化溶解，培养基逐渐澄清（常呈黄褐色）。从顶部开始向下消化较为常见（如 假单胞菌属）。
     • 风暴式消化： 石蕊变蓝，凝块迅速（常在24-48h内）从底部或整个凝块同时剧烈消化，培养基迅速澄清，常伴随大量产气（如 产气荚膜梭菌 Clostridium perfringens）。
   • 伴随酸化或无pH变化的消化： 少数微生物在酸化条件下也能消化蛋白（凝块在酸性环境中溶解），此时石蕊可能保持红色或紫色。

7. 混合反应：

   • 反应可能随时间演变（如先产酸凝固，后缓慢消化并变碱）。
   • 可能同时观察到部分现象（如酸凝固伴随部分消化或还原）。
   • 凝乳酶凝固： 极少数菌能在中性pH下缓慢形成较软的凝块（类似凝乳酶作用），振荡可部分分散。后续可能有消化发生。

下表总结了主要反应模式及其意义：

五、 应用价值

1. 细菌鉴定与分类： 是传统细菌鉴定方案中的重要一环，尤其在鉴定乳酸菌、梭菌、肠杆菌科和非发酵革兰氏阴性杆菌时。不同菌属甚至菌种表现出特征性的反应模式（如产气荚膜梭菌的“风暴式发酵”）。
2. 代谢能力评估： 直观展示微生物对乳糖的发酵能力（产酸、产气）、蛋白水解能力（消化）以及氧化还原能力（还原石蕊）。
3. 教学示范： 因其反应现象直观、多样（颜色变化、凝固、消化、产气），常用于微生物学实验教学中演示微生物的多种生化代谢类型。

六、 局限性

1. 主观性： 结果判读（尤其是消化程度、凝块质地）有一定主观性，需要经验。
2. 复杂性： 多种反应可能同时或先后发生，需仔细追踪观察时间序列变化。
3. 非特异性： 典型的反应模式通常对应一类微生物而非单一菌种，需结合其他生化试验进行鉴定。
4. 耗时性： 观察消化等缓慢反应需要较长时间培养（数天至数周）。
5. 替代方法： 现代临床诊断实验室通常使用更快、更标准化的商品化鉴定系统（如API, VITEK, MALDI-TOF MS），石蕊牛乳试验的应用已减少，但在基础研究、食品微生物学、特定菌种鉴定及教学领域仍有重要价值。

总结

石蕊牛乳试验通过一种培养基同时揭示了微生物复杂的碳水化合物发酵（乳糖）、蛋白质分解（酪蛋白）以及氧化还原代谢活动。解读其产生的颜色变化、凝固、消化、产气等现象，是微生物学家判断菌株生理生化特性的有力工具。尽管在现代快速诊断中应用趋少，它作为一项经典的综合性试验，其原理和直观的反应模式在理解微生物代谢多样性和传统鉴定方法中仍具有不可替代的地位。

参考文献

1. Cappuccino, J. G., & Sherman, N. (2014). Microbiology: A Laboratory Manual (10th ed.). Pearson. (经典微生物学实验手册，详细描述试验步骤与结果解读)
2. Harley, J. P., & Prescott, L. M. (2002). Laboratory Exercises in Microbiology (5th ed.). McGraw-Hill. (包含石蕊牛乳试验原理与操作)
3. MacFaddin, J. F. (2000). Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria (3rd ed.). Lippincott Williams & Wilkins. (权威参考书，深入解析各种生化试验原理及应用，包括石蕊牛乳)
4. Tille, P. M. (2017). Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology (14th ed.). Elsevier. (诊断微生物学综合教材，涵盖传统与现代鉴定方法)