硝酸盐还原试验：原理与应用
硝酸盐还原试验是微生物鉴定中一项重要的生化试验，主要用于检测细菌将硝酸盐（NO₃⁻）还原为亚硝酸盐（NO₂⁻）或其他更低价态含氮产物（如氮气 N₂、氨 NH₃）的能力。该试验在鉴别肠杆菌科、非发酵菌以及某些革兰氏阳性菌方面具有重要价值。
一、 试验原理
某些细菌具有特定的酶系统（硝酸盐还原酶），能够利用培养基中的硝酸盐（NO₃⁻）作为最终电子受体进行厌氧呼吸（无氧条件下），或在有氧条件下作为一种代谢能力。其还原过程可能分步进行：
- 硝酸盐 --> 亚硝酸盐 (NO₂⁻)：这是试验检测的主要步骤。
- 亚硝酸盐 --> 一氧化氮 (NO)
- 一氧化氮 -->氧化亚氮 (N₂O)
- 氧化亚氮 --> 氮气 (N₂)
- 亚硝酸盐/硝酸盐 --> 氨 (NH₃)：部分细菌也可直接将硝酸盐或亚硝酸盐还原为氨。
标准硝酸盐还原试验主要检测细菌是否具有将硝酸盐还原为亚硝酸盐的能力（第一步）。若结果为阴性（未检测到亚硝酸盐），则需要进一步检测亚硝酸盐是否被进一步还原为其他产物（如N₂、N₂O、NH₃等），即进行锌粉试验以判断是否发生完全还原。
二、 所需试剂与培养基
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培养基：
- 硝酸盐肉汤（Nitrate Broth）：主要成分包括蛋白胨（提供氮源和碳源）、硝酸钾（KNO₃，提供硝酸盐底物，终浓度通常为0.1%-0.2%）。有时使用营养肉汤或心脑浸液肉汤等基础培养基添加硝酸钾配制。
- 硝酸盐半固体琼脂：在硝酸盐肉汤中加入少量琼脂（0.3-0.4%），常用于检测厌氧菌的硝酸盐还原能力（穿刺接种）。
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检测试剂（亚硝酸盐检测试剂）：
- 试剂A（磺胺酸溶液）：对氨基苯磺酸（Sulfanilic acid）溶解于稀乙酸（如5N）中。
- 试剂B（α-萘胺溶液）：α-萘胺（α-Naphthylamine）溶解于稀乙酸（如5N）中。 (注意：α-萘胺可能有潜在致癌性，操作需谨慎。也有改良试剂使用N, N-二甲基-1-萘胺等替代)
- (常用组合被称为格里氏试剂，即试剂A和B)
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锌粉（Zinc Dust）：用于锌粉试验，检测硝酸盐是否仍然存在（即判断是否发生完全还原）。
三、 试验步骤
- 接种与培养：
- 取待测菌的纯培养物，接种于硝酸盐肉汤或穿刺接种于硝酸盐半固体琼脂中（后者常用于厌氧培养）。
- 置适宜温度（通常35-37°C）下，进行需氧培养（肉汤）或厌氧培养（半固体琼脂），培养时间通常为18-24小时，某些生长缓慢的菌可延长至5天。
- 观察与初步检测：
- 培养结束后，观察培养物是否生长（浑浊）。
- 向培养物中加入试剂A（约0.1ml或数滴），混匀。
- 再加入试剂B（约0.1ml或数滴），再次混匀。
- 立即观察颜色变化（需在1-2分钟内观察结果）。
- 结果判读（初步检测后）：
- 阳性 (+)：立即或快速（1-2分钟内）出现粉红色、玫瑰红色或红色。表明细菌将硝酸盐还原成了亚硝酸盐，亚硝酸盐与试剂A、B反应生成红色的偶氮化合物。
- 阴性 (-)：无颜色变化（保持试剂加入前的黄色或无色）或呈现试剂本身的淡黄色。表明未检测到亚硝酸盐。但需进一步进行锌粉试验以区分是细菌未还原硝酸盐，还是将亚硝酸盐进一步还原了。
- 锌粉试验（针对初步检测阴性结果）：
- 向初步检测为阴性的培养物中加入少量锌粉（一小刮勺尖或约20mg）。
- 充分混匀。
- 立即观察或静置10-15分钟后观察颜色变化。
- 锌粉试验结果判读：
- 阳性 (硝酸盐未被还原)：加入锌粉后迅速（数秒至数分钟内）出现粉红色或红色。锌粉将培养基中未被动过的硝酸盐化学还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐再与残留的试剂反应显色。说明细菌没有还原硝酸盐的能力（真阴性）。
- 阴性 (硝酸盐已被完全还原)：加入锌粉后无颜色变化（或仅锌粉本身的灰色）。表明培养基中已无硝酸盐供锌粉还原（因为细菌已将硝酸盐完全还原成了N₂、N₂O、NH₃等非亚硝酸盐产物）。说明细菌具有将硝酸盐完全还原为亚硝酸盐以外产物的能力（这也是硝酸盐还原试验阳性的一种表现，称为“完全还原”阳性）。
四、 结果报告
- 硝酸盐还原试验阳性 (+): 初步检测出现红色（仅还原到亚硝酸盐）或 初步检测阴性但锌粉试验阴性（完全还原到氮气、氨等）。
- 硝酸盐还原试验阴性 (-): 初步检测阴性 且 锌粉试验阳性（锌粉成功将硝酸盐还原为亚硝酸盐并显色，证明细菌未还原硝酸盐）。
五、 质量控制与注意事项
- 阳性对照菌：选用已知硝酸盐还原阳性的菌株，如大肠埃希菌（Escherichia coli ATCC 25922）。
- 阴性对照菌：选用已知硝酸盐还原阴性的菌株，如铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853）通常可作为阴性对照（其初步检测阴性，锌粉试验应为阳性）。 (注意：铜绿假单胞菌能还原硝酸盐为氮气，但其初步检测常为阴性，锌粉试验也阴性，故严格来说它应是阳性菌株。更严谨的阴性对照可选用不动杆菌等)。
- 未接种对照管：应包含未接种的培养基管，加入试剂A/B后应无色（证明试剂本身无污染），加入锌粉后应迅速变红（证明培养基中有足量硝酸盐可供还原）。
- 试剂有效性：试剂A和B应无色或淡黄色，若试剂自身呈现粉红色则可能已失效或污染，不能使用。
- 观察时间：加入试剂A/B后显色反应应在1-2分钟内观察。延迟观察可能导致假阴性（亚硝酸盐不稳定）或假阳性（某些细菌代谢产物干扰）。
- 接种量：接种量应充足，保证细菌良好生长。
- 锌粉活性：锌粉应具有活性（新鲜、未受潮氧化），以确保其还原能力。
- 安全：α-萘胺具有潜在致癌性，操作需佩戴手套，在通风橱中进行试剂配制。可使用替代试剂（如含N, N-二甲基-1-萘胺的试剂）。
六、 应用价值与意义
硝酸盐还原试验在临床微生物学和环境微生物学中应用广泛：
- 肠杆菌科鉴定：是区分肠杆菌科成员的关键试验之一。例如：
- 大肠埃希菌：阳性（还原到亚硝酸盐）。
- 产气肠杆菌：阳性（常完全还原）。
- 奇异变形杆菌：阳性。
- 沙门氏菌属：大多阳性。
- 志贺氏菌属：大多阳性。
- 克雷伯菌属：常阳性。
- 沙雷菌属：常阳性。
- 摩根菌属：阳性。
- 普罗威登斯菌属：阳性。
- 耶尔森菌属：各异（鼠疫耶尔森菌通常阴性）。
- 非发酵菌鉴定：
- 铜绿假单胞菌：阳性（完全还原为氮气）。
- 嗜麦芽窄食单胞菌：阳性（还原到亚硝酸盐）。
- 鲍曼不动杆菌：阴性（不变黄铜绿假单胞菌）。
- 产碱杆菌属：通常阴性。
- 厌氧菌鉴定：许多厌氧菌（如拟杆菌属、梭菌属）能还原硝酸盐，是该类菌鉴定流程的一部分（通常使用硝酸盐半固体琼脂进行厌氧培养和检测）。
- 其他细菌：部分葡萄球菌、芽胞杆菌等也可进行该试验辅助鉴定。
- 环境监测：评估水体或土壤中微生物的硝酸盐还原活性，与氮循环过程相关。
七、 总结
硝酸盐还原试验是一项基于细菌代谢能力的经典生化试验。通过检测细菌是否将硝酸盐还原为亚硝酸盐（直接显色阳性）或进一步还原为其他气体或氨（需锌粉试验确认），可以有效地辅助细菌的鉴定分类。准确的操作、正确的试剂使用以及对结果（尤其阴性结果必须进行锌粉试验）的精确判读是保证试验结果可靠的关键。该试验在微生物学实验室，尤其是临床细菌学鉴定中具有不可替代的作用。