胆汁溶菌试验

发布时间：2025-06-20 11:05:05 阅读量：8 作者：生物检测中心

胆汁溶菌试验：原理、操作及临床意义

胆汁溶菌试验（Bile Solubility Test）是临床微生物学中一项关键的鉴别试验，主要用于鉴定肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）并将其与其他α-溶血的链球菌（如草绿色链球菌群）区分开来。

一、 核心原理

该试验基于肺炎链球菌独特的细胞膜特性：

  1. 自溶酶激活：肺炎链球菌能产生一种称为自溶素（Autolysin）的酶。这种酶在细菌生长活跃期通常被抑制。
  2. 胆汁盐的作用：胆汁盐（常用去氧胆酸钠）作为一种表面活性剂，能迅速破坏肺炎链球菌脆弱的细胞膜结构。
  3. 溶菌机制：细胞膜损伤导致细胞内环境改变（渗透压变化、pH变化等），激活了自溶素。活化的自溶素高效降解细菌的肽聚糖细胞壁。
  4. 结果显现：细胞壁的瓦解最终导致细菌裂解死亡，原本混浊的菌悬液变得澄清。其他大多数链球菌（如草绿色链球菌）的细胞膜成分不同，能抵抗低浓度胆汁盐的作用，不会溶解，悬液保持混浊。

二、 试验材料

  1. 试剂：
    • 10% (w/v) 去氧胆酸钠溶液：最常用的试剂。需使用分析纯或更高纯度的去氧胆酸钠粉末溶于无菌生理盐水或蒸馏水中配制，过滤除菌（或购买无菌溶液）。
    • 无菌生理盐水 (0.85-0.9% NaCl)：用于制备菌悬液和阴性对照。
  2. 菌株：
    • 待测菌株：经纯化培养、呈现α-溶血（草绿色溶血环）的革兰氏阳性双球菌或链球菌样细菌。
    • 阳性质控菌株：已知胆汁溶菌试验阳性的肺炎链球菌标准菌株。
    • 阴性质控菌株：已知胆汁溶菌试验阴性的草绿色链球菌标准菌株（如轻型链球菌Streptococcus mitis或唾液链球菌Streptococcus salivarius）。
  3. 其他：
    • 无菌试管（如13×100 mm规格）
    • 无菌吸管或移液器及吸头
    • 麦氏比浊管或等效浊度标准（用于调整菌悬液浓度）
    • 35-37°C 恒温培养箱或水浴锅
    • 计时器

三、 操作步骤（试管法）

  1. 制备菌悬液：取待测菌、阳性对照菌（肺炎链球菌）、阴性对照菌（草绿色链球菌）的新鲜过夜纯培养物（通常使用血琼脂平板），分别用无菌生理盐水制备成浓度约为0.5-1.0 麦氏标准的均一菌悬液（浊度相当于约1.5 × 10^8 CFU/mL）。
  2. 分装：取两支无菌试管，分别标记为“试验管”和“对照管”。
  3. 加样：
    • 向“试验管”中加入1mL菌悬液 + 0.1mL（或2滴）10%去氧胆酸钠溶液。
    • 向“对照管”中加入1mL菌悬液 + 0.1mL（或2滴）无菌生理盐水。
  4. 混匀：轻轻摇动或涡旋试管数次，使内容物充分混合。
  5. 孵育：将两支试管置35-37°C环境（培养箱或水浴锅）中孵育。
  6. 观察：
    • 首次观察：孵育 15分钟 后取出试管。
    • 检查浊度变化：将试管置于光线良好的背景下，与对照管比较，观察试验管中的液体是否从混浊变为澄清或明显变清。
    • 后续观察（可选）：如果15分钟时变化不明显（部分菌株溶解较慢），可将试管继续孵育至 30分钟或60分钟，再次观察。超过60分钟通常不再有意义。
  7. 记录结果：分别记录待测菌、阳性对照、阴性对照的结果。

四、 结果判读

  • 阳性结果：试验管在15-60分钟内由均匀混浊变为澄清透明（液体可略带颜色，但无颗粒或浑浊）。对照管应始终保持混浊。
    • 意义：强烈提示该菌株为肺炎链球菌。
  • 阴性结果：试验管在60分钟内无明显变化，或仅出现轻微絮状沉淀但液体总体仍混浊（与对照管浊度相似）。对照管应始终保持混浊。
    • 意义：该菌株不是肺炎链球菌（通常为草绿色链球菌群成员）。
  • 无效结果：
    • 阳性对照管未溶解（澄清）：试验无效。可能是试剂失效、孵育温度不当、质控菌株不纯或死亡等。
    • 阴性对照管发生溶解（澄清）：试验无效。可能是试剂污染或加样错误。
    • 试验管和对照管均澄清：试验无效。可能是菌悬液浓度过低或细菌本身死亡。

五、 质量控制

  • 每次试验必须同时进行阳性质控和阴性质控。
  • 质控结果必须符合预期（阳性溶解，阴性不溶），试验结果才可信。
  • 使用新鲜配制的试剂或在有效期内、储存得当的试剂。
  • 确保菌悬液浓度合适（过稀导致溶解不明显，过浓可能延长溶解时间）。
  • 严格控制孵育时间和温度。

六、 临床意义与应用

  1. 肺炎链球菌的关键鉴定标志：胆汁溶菌试验阳性是鉴定肺炎链球菌最可靠、最特异的传统试验方法之一，尤其在与形态和溶血特征相似的草绿色链球菌区分时至关重要。
  2. 指导抗生素选择：快速准确鉴定肺炎链球菌有助于临床医生及时选用针对性的抗生素（如青霉素类、三代头孢菌素等），避免使用对草绿色链球菌无效或效果不佳的药物。肺炎链球菌对青霉素的敏感性测试（是否耐药）也是后续重要步骤。
  3. 呼吸道标本分离株的鉴别：在从痰液、肺泡灌洗液、血液等标本中分离出α-溶血性革兰氏阳性球菌时，胆汁溶菌试验是快速鉴定的核心手段。
  4. 与其他试验互补：通常与奥普托欣（Optochin）敏感性试验联合使用。绝大多数肺炎链球菌对Optochin敏感（抑菌圈≥14mm）且胆汁溶菌阳性，双重确认可提高准确性。极少见Optochin不敏感但胆汁溶菌阳性的肺炎链球菌变异株。

七、 优势与局限

  • 优势：
    • 原理明确，操作相对简单快捷（通常在30分钟内可初步判断）。
    • 成本低廉。
    • 特异性高（阳性结果基本可确认为肺炎链球菌）。
  • 局限：
    • 敏感性并非绝对100%。罕见情况下，某些肺炎链球菌菌株（如自溶酶缺陷株）可能呈弱阳性或延迟阳性，甚至假阴性。
    • 需要新鲜、活跃生长的纯培养物（陈旧培养物可能因细菌已进入自溶期而出现假阳性）。
    • 结果判读带有一定的主观性（澄清度的判断），尤其对部分溶解的情况需谨慎。浑浊度的轻微变化需与对照管仔细比较。
    • 不能用于直接检测临床标本（如脑脊液），只能用于分离培养后的纯菌落。

八、 注意事项

  1. 无菌操作：整个试验过程需严格遵守无菌操作规范，避免污染。
  2. 试剂浓度：务必使用正确浓度的去氧胆酸钠溶液（通常为10%），浓度过高可能导致非特异性溶解，浓度不足则溶解效果不佳。
  3. 菌龄控制：务必使用18-24小时的新鲜培养物。老龄培养物中的细菌可能已开始自溶，导致假阳性结果。
  4. 孵育时间：严格计时。超过推荐时间可能导致草绿色链球菌出现非特异性缓慢溶解（假阳性）。
  5. 浊度对比：务必设置生理盐水对照管。判断试验管是否溶解时，必须与对照管进行平行比较。
  6. 生物安全：肺炎链球菌是重要的病原菌，操作应在符合相应生物安全等级（通常为BSL-2）的实验室进行，采取必要的个人防护措施（如实验服、手套）。在配制菌悬液、加样及观察过程中，尤其是在产生气泡时，需注意防止产生气溶胶。

总结：

胆汁溶菌试验以肺炎链球菌细胞膜对胆汁盐的敏感性及其自溶酶系统的激活为核心机制，通过观察菌悬液在去氧胆酸钠作用下的溶解澄清现象，实现对肺炎链球菌的高特异性鉴定。它是临床微生物实验室鉴别α-溶血链球菌、确诊肺炎链球菌感染不可或缺的传统经典方法。规范的操作、严格的质控以及对结果（尤其是临界状态）的审慎判读，是保证试验结果准确可靠的关键。该试验为呼吸道感染等疾病的病原学诊断和合理抗菌治疗提供了重要依据。