卵磷脂酶试验

发布时间：2025-06-20 11:03:08 阅读量：10 作者：生物检测中心

卵磷脂酶试验：原理、操作与临床应用

一、概述

卵磷脂酶试验是一种经典的微生物学生化鉴定试验，主要用于检测细菌（特别是厌氧菌中的梭菌属）能否产生卵磷脂酶（一种特异性水解卵磷脂的酶）。该酶属于磷脂酶C的一种，能分解细胞膜和蛋黄中的卵磷脂。该试验在临床微生物学、食品卫生检测和基础研究中具有重要价值，是鉴定产气荚膜梭菌等关键病原体的重要依据之一。

二、试验原理

  1. 底物： 试验的核心底物是卵磷脂。天然卵磷脂来源于蛋黄。
  2. 酶的作用： 若待测菌株能产生卵磷脂酶，该酶即可催化卵磷脂水解：
    • 卵磷脂 + H₂O → 磷酸胆碱 + 二酰基甘油
  3. 显色/沉淀反应：
    • 水解产生的二酰基甘油（甘油二酯） 是一种不溶于水的脂质。
    • 在含有蛋黄成分（富含卵磷脂）的固体培养基上（如卵黄琼脂），菌落周围会因二酰基甘油的析出而形成一层不透明的乳白色浑浊环或晕圈（有时描述为珍珠光泽层）。
  4. 结果判定：
    • 阳性： 菌落周围出现清晰可见的、界限分明的不透明浑浊环或晕圈。
    • 阴性： 菌落周围培养基保持透明澄清，无浑浊晕圈形成。

三、试验材料与方法

  1. 培养基： 最常用的是卵黄琼脂培养基（Egg Yolk Agar, EYA）。

    • 基础培养基： 常选用营养丰富的培养基作为基础，如胰酪蛋白大豆琼脂（TSA）、哥伦比亚琼脂等。
    • 卵黄悬液： 无菌条件下分离新鲜鸡蛋蛋黄，与无菌生理盐水按一定比例（通常5-10% v/v）混合制成悬液。
    • 制备： 将基础培养基高压灭菌后冷却至约50°C，无菌操作加入适量卵黄悬液（终浓度通常约为5%）, 轻轻摇匀避免产生气泡，倾注平板。

  2. 试验操作步骤：

    1. 将卵黄琼脂平板在37°C温箱中放置短暂时间，使表面干燥（避免冷凝水干扰结果观察）。
    2. 接种：
      • 点种法（推荐）： 用接种环或针挑取待测菌的纯培养物，在平板上点种（通常点成一簇或一条短线）。此法能产生清晰的晕圈，易于辨别。
      • 划线法： 也可用接种环划线接种，但因菌落分散，晕圈可能不如点种法明显。
    3. 培养：
      • 需氧菌： 需氧条件下（通常在大气环境），于35-37°C培养18-24小时。
      • 厌氧菌（如梭菌）： 必须在严格厌氧环境（如厌氧罐、厌氧工作站）中，于35-37°C培养24-48小时（部分菌株可能需要更长时间）。
    4. 结果观察： 小心取出平板，在良好光线下（尤其是侧面光）观察菌落周围是否出现不透明的乳白色浑浊环或晕圈。记录阳性或阴性结果。

四、结果解释与临床意义

  • 阳性结果： 表明该菌株能产生卵磷脂酶。
  • 阴性结果： 表明该菌株不产生卵磷脂酶或产量不足以被检测到。

主要应用与意义：

  1. 产气荚膜梭菌鉴定：

    • 产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是该试验最重要的应用对象。该菌产生强力的卵磷脂酶（α毒素），是其主要的致病因子之一。
    • 在卵黄琼脂上进行点种培养，产气荚膜梭菌通常能在菌落周围产生宽大、显著的不透明浑浊环（Nagler反应阳性），通常在厌氧培养24小时内即可观察到。
    • 这是鉴定产气荚膜梭菌的关键特征性试验，常与其他试验（如动力、硝酸盐还原、乳糖发酵、双圈溶血等）结合使用。

  2. 其他梭菌的鉴别：

    • 用于区分不同种类的梭菌。例如：
      • 诺维梭菌（C. novyi）A型通常阳性。
      • 双酶梭菌（C. bifermentans）、索氏梭菌（C. sordellii）也可呈阳性。
      • 艰难梭菌（C. difficile）、破伤风梭菌（C. tetani）、肉毒梭菌（C. botulinum）通常为阴性。

  3. 其他细菌的鉴定： 少数其他细菌（如某些金黄色葡萄球菌菌株、蜡样芽胞杆菌）也可能产生卵磷脂酶，呈现阳性，但需结合其他生化特征进行鉴别。

  4. 毒素研究： 用于研究细菌（特别是梭菌）的毒力因子和致病机制。

五、注意事项与质量控制

  1. 卵黄质量： 必须使用新鲜鸡蛋制备卵黄悬液。陈旧鸡蛋或处理不当（细菌污染）会影响结果。
  2. 培养基制备： 基础培养基灭菌后需充分冷却（约50°C）再加入卵黄悬液，避免凝固卵黄蛋白。加入卵黄后应避免剧烈摇动产生气泡。
  3. 接种量： 接种量应适中。过少可能导致弱阳性菌株不显色；过多可能使菌苔过厚，干扰晕圈观察（点种法更佳）。
  4. 培养条件： 严格遵守厌氧菌所需的厌氧条件（使用有效的厌氧环境和指示剂）。培养时间需足够，部分菌株反应较慢。
  5. 结果判读：
    • 观察时需在良好光线下，从不同角度（特别是侧面光）观察晕圈。
    • 区分真正的卵磷脂酶反应（晕圈紧贴菌落，界限清晰）与细菌代谢导致的普遍浑浊或沉淀。
  6. 假阳性： 某些菌株代谢可能产生脂肪酶，分解蛋黄中的甘油三酯，在菌落周围形成一层有光泽的珠光层（Pearl layer）。这需要与卵磷脂酶产生的不透明浑浊环（opaque zone） 仔细区分。珠光层通常更薄、有光泽且紧贴菌落，不像卵磷脂酶晕圈那样呈明显均匀的乳白色不透明状。必要时可结合其他生化试验或使用卵磷脂酶特异性抑制剂（如抗α毒素血清进行中和试验）进行确认（中和区无浑浊晕圈）。
  7. 生物安全： 操作致病菌株（如产气荚膜梭菌）必须在相应生物安全等级的实验室进行。
  8. 质控菌株：
    • 阳性对照： 产气荚膜梭菌标准菌株（如ATCC 13124）。
    • 阴性对照： 不产卵磷脂酶的菌株（如脆弱拟杆菌ATCC 25285 或 艰难梭菌ATCC 9689）。

六、总结

卵磷脂酶试验是一种基于酶-底物反应、通过观察菌落周围浑浊环形成来判断细菌产卵磷脂酶能力的经典生化试验。其核心价值在于快速、直观地鉴定产气荚膜梭菌这一重要病原体，并在其他梭菌及部分细菌的鉴别诊断中发挥作用。准确的操作（特别是制备合格卵黄琼脂、严格厌氧培养）、细致的观察（区分不透明晕圈与珠光层）以及结合其他鉴定试验，是确保该试验结果可靠的关键。该试验在临床微生物实验室诊断食源性疾病、伤口感染（尤其是气性坏疽）、菌血症以及基础微生物研究中具有不可替代的地位。

参考文献： (此处应列出微生物学标准操作规程、权威教材或指南名称如CLSI M100, Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology等，避免具体厂商手册)