氧化酶试验

氧化酶试验：原理、方法与临床意义详解

氧化酶试验是微生物学实验室中一项基础且关键的生化试验，主要用于检测细菌细胞色素c氧化酶的存在。该酶是细菌需氧呼吸链末端的重要组分，其检测结果对细菌鉴定，特别是革兰氏阴性杆菌和某些球菌的分类具有重要价值。

一、 试验原理

氧化酶试验的核心在于检测细胞色素c氧化酶的活性。这种酶存在于某些细菌的呼吸链中，其功能是在有氧条件下，将电子从细胞色素c传递给分子氧（O₂），将其还原成水（H₂O），并在此过程中产生能量（ATP）。

检测机制：

1. 氧化酶试剂的作用： 试验中使用的试剂（最常用的是四甲基对苯二胺盐酸盐或硫酸盐，TMPD）是一种人工合成的还原型染料（无色或浅色）。
2. 电子传递： 当细菌含有活性的细胞色素c氧化酶时，该酶能将试剂分子（如TMPD）氧化。
3. 显色反应： 被氧化的试剂分子（如TMPD被氧化成靛酚蓝）会发生分子结构变化，呈现出明显的颜色（通常为深蓝色、蓝紫色或紫红色）。
4. 结果判断： 因此，颜色的出现（通常在10-30秒内）即表明细胞色素c氧化酶的存在，判读为阳性；无颜色变化则为阴性。

二、 试验方法

常用方法有以下几种：

1. 滤纸片法（最常用）：

   • 取一小片洁净的无荧光滤纸置于培养皿盖或玻片上。
   • 用滴管或接种环滴加1-2滴新鲜配制的1%四甲基对苯二胺水溶液（或按说明书配制）于滤纸上，使其湿润。
   • 用铂金环（或塑料/玻棒，避免含铁金属干扰）挑取18-24小时新鲜纯培养的菌落，涂抹在湿润的滤纸片上。
   • 立即观察颜色变化（10-30秒内）。阳性反应通常表现为涂抹区域出现深蓝色、蓝紫色或紫红色。

2. 菌落直接法：

   • 直接将1-2滴氧化酶试剂滴加到平板上分离良好的单个可疑菌落表面。
   • 立即观察菌落及其周围培养基的颜色变化。阳性反应表现为菌落变为粉红色，继而变为深红色、紫红色或黑色（颜色变化速度及最终颜色与试剂种类和菌种有关）。

3. 试纸条法：

   • 使用市售的专用氧化酶试验试纸条。
   • 按说明书要求，用无菌棉签或接种环取菌落涂抹在试纸条的反应区。
   • 在规定时间内（通常30-60秒） 观察试纸条反应区是否出现特定的颜色变化（通常为蓝色或紫色），判读结果。

三、 结果判读与注意事项

• 阳性结果： 涂抹菌落处或菌落本身在10-30秒内出现深蓝色、蓝紫色或紫红色。颜色出现越快、越深，通常表示酶活性越强。
• 阴性结果： 无颜色变化或仅在超过60秒后出现微弱的颜色（通常认为无意义）。
• 关键注意事项：
  • 试剂： 必须使用新鲜配制的试剂。四甲基对苯二胺水溶液极不稳定，暴露在空气中会缓慢氧化变色失效，应储存于避光密闭的棕色瓶中（通常建议4℃保存不超过1周，或按说明书），临用前配制最佳。变色的试剂不可使用。
  • 菌龄： 必须使用18-24小时的新鲜培养物。陈旧培养物酶活性可能下降导致假阴性。
  • 挑取工具： 避免使用含铁金属（如镍铬合金或铁丝）的接种环，因为铁离子可能催化试剂氧化导致假阳性。推荐使用铂金环、塑料棒或玻棒。
  • 判读时间： 必须在加试剂后10-30秒内判读结果。延迟判读可能导致假阳性（试剂在空气中自然氧化）或假阴性（阳性反应颜色可能褪去）。
  • 培养基： 挑取菌落时避免带入过多培养基成分（尤其是含糖或血液的培养基），可能干扰反应或导致假阴性。
  • 避光： 试剂对光敏感，配制和储存应避光。

四、 临床应用与意义

氧化酶试验在临床微生物学鉴定中具有重要价值，尤其在初步区分革兰氏阴性菌方面：

1. 关键鉴别点：

   • 肠杆菌科细菌： 绝大多数为氧化酶阴性（如大肠埃希菌、克雷伯菌属、沙门菌属、志贺菌属、变形杆菌属等）。这是区分肠杆菌科与其他氧化酶阳性的革兰氏阴性杆菌（如假单胞菌属）的首要试验。
   • 非发酵糖革兰氏阴性杆菌： 许多重要的非发酵菌为氧化酶阳性，例如：
     • 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
     • 嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia - 阳性或弱阳性）
     • 产碱杆菌属（Alcaligenes spp.）
     • 无色杆菌属（Achromobacter spp.）
     • 莫拉菌属（Moraxella spp.）
     • 部分不动杆菌属（Acinetobacter spp. - 通常阴性，但某些菌株可能呈弱阳性或延迟阳性，需结合其他试验）
   • 弧菌科与气单胞菌科： 弧菌属（Vibrio spp.，如霍乱弧菌、副溶血弧菌）和邻单胞菌属（Plesiomonas shigelloides）为氧化酶阳性。气单胞菌属（Aeromonas spp.）也多为阳性。这是区分它们与肠杆菌科的重要指标。
   • 弯曲菌属（Campylobacter spp.）： 氧化酶阳性。
   • 奈瑟菌属（Neisseria spp.）和莫拉菌属（Moraxella spp.）： 氧化酶阳性（脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌等）。这是鉴定这些球菌的重要试验之一。
   • 巴斯德菌属（Pasteurella spp.）： 氧化酶阳性。

2. 初步筛选与鉴定流程： 氧化酶试验通常是细菌鉴定流程中的第一步或第二步（在革兰染色之后）。一个阳性的氧化酶结果会立即将鉴定方向指向非肠杆菌科的革兰氏阴性杆菌、弧菌、奈瑟菌等。而阴性结果则大大增加了属于肠杆菌科的可能性。

3. 流行病学与感染控制： 对于医院感染中常见的病原体如铜绿假单胞菌，氧化酶试验是快速初步鉴别的有效手段之一。

五、 质量控制

为确保试验结果准确可靠，应定期进行质量控制：

• 阳性对照菌株： 铜绿假单胞菌（ATCC 27853）或脑膜炎奈瑟菌（ATCC 13090）。每次试验或新配制试剂时应做阳性对照，预期结果为阳性（快速显色）。
• 阴性对照菌株： 大肠埃希菌（ATCC 25922）。每次试验或新配制试剂时应做阴性对照，预期结果为阴性（无颜色变化或60秒后仍无色）。
• 试剂对照： 在滤纸片或玻片上滴加试剂但不加菌，观察10-30秒。应无颜色变化或仅有极缓慢的微弱变色（试剂在空气中自然氧化）。如果试剂对照迅速显色，说明试剂已失效或被污染，不可使用。

总结

氧化酶试验以其操作简便、快速（30秒内出结果）、成本低廉和鉴别价值高的特点，成为临床微生物学实验室不可或缺的基础试验。准确理解和规范操作该试验，并严格遵守注意事项（特别是试剂新鲜度、判读时间和挑取工具），对于确保结果可靠性、正确引导后续鉴定流程、最终实现细菌的准确鉴定至关重要。它是区分肠杆菌科与非发酵菌、弧菌、奈瑟菌等关键菌群的首要生化试验之一。