精氨酸双水解酶试验：原理、方法与应用
一、引言 精氨酸双水解酶试验（Arginine Dihydrolase Test, ADH Test）是一项重要的微生物生化鉴定试验，主要用于区分肠杆菌科、非发酵菌（如假单胞菌属）及其他某些细菌。该试验基于细菌对精氨酸的两种特异性代谢能力，是临床微生物学和环境微生物学鉴定流程中的关键步骤。
二、生化原理 精氨酸双水酶途径包含两步连续的酶促反应：
- 精氨酸脱亚胺酶（ADI）作用： 精氨酸 + H₂O → 瓜氨酸 + NH₃
- 鸟氨酸氨甲酰转移酶（OTC）作用： 瓜氨酸 + 无机磷酸盐 → 鸟氨酸 + 氨甲酰磷酸盐
- 氨甲酰磷酸盐 + ADP → 碳酸盐 + 磷酸盐 + ATP (由氨甲酰磷酸激酶催化，或自发水解)
- 氨甲酰磷酸盐 + H₂O → 碳酸盐 + 磷酸盐 + 2H⁺ (+CO₂?)
整个代谢途径最终产生：
- 碱性产物： 氨（NH₃）
- 酸性产物： 碳酸（分解为CO₂和H₂O）和可能的额外H⁺
- 能量（ATP）
关键在于，精氨酸的降解导致碱性产物（NH₃）和酸性产物（CO₂/H⁺）同时产生。在密闭的测试环境中（如试管或小管），初始的碱性反应会被后续的酸性反应所抵消或超越，最终导致培养基酸化。
三、试验目的
- 主要用于区分肠杆菌科细菌（如阴沟肠杆菌、产气克雷伯菌、蜂房哈夫尼亚菌等通常阳性；大肠埃希菌、志贺氏菌属、普罗维登斯菌属等通常阴性）。
- 帮助区分假单胞菌属细菌（如铜绿假单胞菌通常阳性，荧光假单胞菌阴性）。
- 辅助鉴定肠球菌属（通常阳性）与链球菌属（通常阴性）。
- 鉴定其他能利用精氨酸途径的细菌。
四、培养基 常用含精氨酸的专用培养基：
- 基础成分示例（无商品名）：
- 蛋白胨：提供氮源和生长因子
- 氯化钠：维持渗透压
- L-精氨酸：特定底物（通常约1%浓度）
- 酚红：酸碱指示剂（通常0.001-0.002%）
- 葡萄糖：微量（≤0.1%）或无（避免发酵产酸干扰）
- 琼脂：用于斜面或穿刺试验（约0.3-0.5%，半固体）
五、试验方法（以Moeller法/试管法为例）
- 培养基制备： 按标准配方准确称量各组分，溶解于蒸馏水中，调整pH至约6.8-7.0（此时酚红呈琥珀色至橙黄色）。分装于带螺帽的小试管（如13×100 mm）中，每管约3-4 ml。高压灭菌（121°C, 15分钟）。取出后直立放置冷却凝固，形成高层琼脂柱。
- 接种： 取待测菌的18-24小时纯培养物，用无菌接种针穿刺接种至培养基深部（接近管底），并沿穿刺线轻轻抽回接近表面（模拟斜面划线）。
- 覆盖无菌石蜡油（关键步骤）： 在已凝固的培养基表面无菌加入约1 cm厚的无菌液体石蜡油或矿物油，形成厌氧环境（密封隔绝空气，利于精氨酸双水解途径产酸）。
- 孵育： 将试管置于35±2°C培养箱中培养。通常在培养后第1、2、3、4、7天观察结果。大多数肠杆菌科细菌在24-48小时内可呈现阳性结果，某些菌种（如部分肠球菌、假单胞菌）或弱反应菌株可能需要更长时间（最多7天）。
- 对照设置（每次试验必备）：
- 阳性对照： 使用已知ADH阳性的标准菌株（如阴沟肠杆菌ATCC 13047、铜绿假单胞菌ATCC 27853）。
- 阴性对照： 使用已知ADH阴性的标准菌株（如大肠埃希菌ATCC 25922）。
- 未接种对照： 一支只含培养基和石蜡油的试管。
六、结果判读
- 阳性结果 (+)： 培养基颜色由接种时的橙色/琥珀色变为黄色。这表示产酸（精氨酸双水解途径产生的酸性产物占主导），导致pH下降。黄色出现的位置通常在深层或整个培养基柱。
- 阴性结果 (-)： 培养基保持橙色/琥珀色或变为更深的红色/紫红色。保持原色表明无显著代谢变化，变红表明产碱（仅发生第一步精氨酸脱亚胺反应产生大量NH₃，或存在其他产碱途径），导致pH上升。
- 无效结果： 培养基浑浊但颜色无变化（部分非发酵菌可能仅微弱生长但不代谢精氨酸），或对照管结果不符。需重复试验。
七、质量控制
- 阳性对照管： 应在24-48小时内显示明确的黄色（阳性反应）。
- 阴性对照管： 应保持橙色/琥珀色或仅轻微变红（阴性反应）。
- 未接种对照管： 应保持原始颜色（橙色/琥珀色）。
- 使用标准菌株定期（如新批次培养基使用前）验证试验性能。
- 确保石蜡油覆盖完全，形成有效厌氧环境。
- 严格遵守孵育时间和温度。
八、临床及鉴定意义
- 肠杆菌科： 是区分某些属和种的关键试验。阳性菌如阴沟肠杆菌、产气克雷伯菌、奇异变形杆菌（吲哚阴性变形杆菌）；阴性菌如大肠埃希菌、志贺氏菌属、沙门氏菌属（多数）、摩根氏菌属、普罗维登斯菌属。对区分克雷伯菌属（通常阳性）与大肠埃希菌（阴性），以及肠杆菌属（阳性）与沙雷氏菌属（阴性）有帮助。
- 非发酵菌： 铜绿假单胞菌通常阳性，荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌通常阴性。有助于区分这些常见病原菌。
- 革兰阳性球菌： 肠球菌属（如粪肠球菌、屎肠球菌）通常阳性，链球菌属（如肺炎链球菌、无乳链球菌）通常阴性，是重要的鉴别试验。
- 其他： 用于鉴定气单胞菌属、弧菌属等。
九、注意事项与局限性
- 厌氧环境是关键： 石蜡油覆盖不严会导致假阴性（氧气抑制双水解途径）。
- 培养基成分： 葡萄糖含量过高会导致发酵产酸，掩盖精氨酸代谢结果，造成假阳性。酚红浓度需适宜。
- 接种量： 接种物应足够以保证生长。
- 孵育时间： 部分菌株反应较慢，需培养至7天观察。过早判读可能导致假阴性。
- 指示剂范围： 酚红在pH 6.8(黄) - 8.4(红)间变色。pH轻微变化可能不易察觉，需仔细对比。
- 菌株变异性： 同一菌种内可能存在生化反应不规则的菌株。
- 非特异性反应： 其他代谢途径可能导致培养基颜色变化，需结合其他试验综合判断。
十、安全须知
- 所有操作应在生物安全柜或适当防护下进行，尤其处理临床样本分离菌株。
- 高压灭菌使用过的培养基、试管和接种针。
- 处理废弃培养基和石蜡油需遵守实验室生物安全和化学废弃物处理规定。
结论 精氨酸双水解酶试验是一种基于特异性代谢途径的经典生化试验，通过检测细菌利用精氨酸途径最终导致的产酸现象来判断酶活性。其在肠杆菌科、非发酵菌和革兰阳性球菌的鉴别诊断中具有重要价值。严格遵循操作规范（特别是厌氧环境的建立）、使用可靠培养基、设置对照并充分孵育是确保结果准确可靠的关键。该试验是微生物鉴定系统（如API 20E等商品化系统）中精氨酸相关检测模块的基础原理之一。理解其原理和判读要点对于准确进行细菌鉴定至关重要。