氨基酸脱羧酶试验

氨基酸脱羧酶试验：原理与应用

氨基酸脱羧酶试验是微生物学中一项重要的生化检测手段，专门用于鉴定细菌是否具有特定氨基酸脱羧能力。该试验在肠杆菌科等细菌的鉴别诊断中扮演着关键角色。

一、 核心原理与生化基础

氨基酸脱羧酶的本质功能是催化氨基酸脱去α-羧基，生成相应的胺类化合物和二氧化碳。以赖氨酸和鸟氨酸为例：

• 赖氨酸脱羧酶： 赖氨酸 → 尸胺(Cadaverine) + CO₂
• 鸟氨酸脱羧酶： 鸟氨酸 → 腐胺(Putrescine) + CO₂

反应产生的胺类物质具有碱性，能显著提高培养基的pH值。实验采用的培养基含有：

• 葡萄糖： 提供初始发酵底物，发酵产酸使培养基变黄（指示剂显色）。
• 特定氨基酸： （如赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸）作为脱羧酶的底物。
• pH指示剂(如溴甲酚紫)： 酸性时呈黄色(pH<5.2)，碱性时呈紫色(pH>6.8)。

判断依据： 若细菌具备目标氨基酸脱羧酶能力，初期发酵葡萄糖产酸使培养基变黄；随后脱羧反应产生的碱性胺类物质逐渐积累并中和酸性，最终使培养基由黄变紫（阳性结果）。若细菌缺乏该酶，则培养基保持黄色（阴性结果）。无氨基酸的对照管应始终保持黄色（验证仅发酵葡萄糖）。

二、 标准操作规程与方法要点

1. 培养基制备：

   • 使用专用脱羧酶基础培养基（通常含蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、吡哆醛、指示剂等）。
   • 分装基础液，按要求加入L-赖氨酸、L-鸟氨酸或L-精氨酸（浓度通常为1%）。必须设置不含氨基酸的基础培养基作为阴性对照管。
   • 灭菌条件需温和（如115℃ 10分钟），避免过热破坏成分（特别是精氨酸）。
   • 灭菌后，培养基应呈紫色（微碱性）。若呈黄色可能已变质，需弃用。

2. 接种与培养：

   • 取待测菌的纯新鲜培养物，接种试验管及对照管。
   • 接种后，在培养基表面覆盖一层约4-5mm厚的无菌液体石蜡或矿物油，创造厌氧微环境（这对脱羧酶活性至关重要）。
   • 置培养箱中，35-37℃培养，通常观察时间为1-4天（肠杆菌科一般1-2天，其他菌或弱反应可能需要更久）。

3. 结果判读：

   • 阳性(+): 试验管培养基最终变为紫色（碱性）。注意微弱阳性可能表现为管底淡紫、上部黄色。
   • 阴性(-): 试验管培养基保持黄色（酸性或中性）。
   • 对照管： 不含氨基酸的对照管应始终保持黄色。若对照管变紫，试验结果无效。
   • 未生长： 所有管均无变化（保持接种前紫色），表示细菌未生长，结果无法判断。

三、 关键临床意义与应用价值

氨基酸脱羧酶试验是鉴定肠杆菌科细菌的核心试验之一：

• 沙门菌属： 通常赖氨酸脱羧酶阳性(+)（伤寒沙门菌等），鸟氨酸脱羧酶多阳性(+)。
• 志贺菌属： 通常赖氨酸脱羧酶阴性(-)，大多数宋内志贺菌鸟氨酸脱羧酶阳性(+)，其他志贺菌为阴性。
• 大肠埃希菌： 赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶结果不定，是菌株鉴别的指标之一（如致病性大肠杆菌某些型别赖氨酸阳性）。
• 变形杆菌属： 普通变形杆菌和奇异变形杆菌通常赖氨酸脱羧酶阴性(-)，奇异变形杆菌鸟氨酸脱羧酶阳性(+)。
• 克雷伯菌属： 通常赖氨酸脱羧酶阳性(+)。
• 肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、沙雷菌属等： 不同种的脱羧酶模式各异，是重要的鉴别依据。
• 非发酵菌（如铜绿假单胞菌）： 精氨酸脱羧酶（或双水解酶通路）试验常用于鉴别（阳性）。

四、 质量控制与注意事项

• 对照： 每次试验必须包含阳性菌株（如赖氨酸：鼠伤寒沙门菌；鸟氨酸：奇异变形杆菌；精氨酸：阴沟肠杆菌）和阴性菌株（如赖氨酸：费氏柠檬酸杆菌；鸟氨酸：普通变形杆菌），以及无氨基酸对照管。
• 覆盖物： 无菌石蜡/矿物油的覆盖不可省略，这是产生足够碱性胺的关键。
• 培养时间： 观察阴性结果需足够时间（通常≥4天），避免早期误判。
• 接种量： 宜浓不宜淡，保证充足菌量。
• 指示剂： 准确识别颜色变化，微弱阳性需仔细辨别。
• 培养基： 确保基础培养基质量可靠且不过热灭菌。

五、 与其他试验的协同应用

氨基酸脱羧酶试验通常需结合其他生化试验（如TSI、IMViC、尿素酶、动力、H₂S、ONPG、枸橼酸盐利用等）进行综合鉴定，才能准确判定细菌种属。它是构建细菌生化鉴定谱系不可或缺的关键环节。

总结而言，氨基酸脱羧酶试验通过检测细菌对特定氨基酸的脱羧能力及其导致的pH变化，为微生物学家提供了区分细菌种类、尤其是肠杆菌科各属种的有力工具。严格遵循操作规程和质量控制，是其结果准确可靠的根本保障。