尿素酶试验：原理、操作与临床应用
尿素酶试验是微生物学实验室中一项重要的生化试验，主要用于鉴定细菌是否能够产生尿素酶。该酶能水解尿素，生成氨和二氧化碳。这项试验在鉴定肠道杆菌（特别是变形杆菌属、普罗维登斯菌属和摩根菌属）以及幽门螺杆菌等具有重要临床意义的细菌中扮演着关键角色。
一、 试验原理
尿素酶试验基于细菌产生的尿素酶催化尿素水解的能力。尿素水解的化学反应式如下：
(NH₂)₂CO + H₂O + Urease → 2NH₃ + CO₂
反应产生的氨（NH₃）是一种碱性物质，会导致培养基的pH值显著升高。在培养基中加入的pH指示剂（通常是酚红）会根据环境的酸碱度改变颜色：
- 酸性或中性环境 (pH < 6.8)： 酚红呈黄色。
- 碱性环境 (pH > 8.1)： 酚红呈粉红色或紫红色。
因此，当细菌产生尿素酶并水解尿素产生氨时，培养基的pH值升高，指示剂由黄色变为粉红色或紫红色，即为阳性反应。如果细菌不产生尿素酶，则尿素不被分解，培养基保持酸性或中性（通常为黄色），即为阴性反应。
二、 培养基与试剂
- 基础培养基： 通常为蛋白胨水或营养肉汤。
- 尿素： 作为底物，浓度通常为2%。
- pH指示剂： 常用酚红（0.0012%），也可使用其他指示剂如溴百里酚蓝。
- 缓冲液： 常用磷酸盐缓冲液，以维持培养基初始pH值并防止因其他代谢产酸导致的假阴性。
- 最终pH值： 培养基灭菌并冷却后，pH值应调整在6.8左右（呈黄色或橙黄色）。
三、 试验操作步骤
- 培养基制备： 根据标准配方准确称量各成分（尿素除外），溶解于蒸馏水中。调整pH至约6.8。分装于合适的容器（如试管）。高压灭菌（121°C，15分钟）。待培养基冷却至约50°C时，以无菌操作加入过滤除菌的尿素溶液（20%或40%），混匀，使尿素终浓度达到1-2%。立即分装于无菌试管中（每管约2-3ml）。
- 接种： 用接种环挑取待测细菌的纯培养物（18-24小时新鲜菌落），接种于尿素培养基中。对于苛养菌如幽门螺杆菌，可采用固体斜面或特殊培养基，划线接种。
- 培养： 将接种后的培养基置于适宜该细菌生长的温度（通常为35-37°C）下进行培养。
- 观察结果： 在培养不同时间点（如4-6小时、24小时、48小时或更长时间，取决于待测菌的生长速度和预期反应速度）观察培养基颜色的变化。
- 阳性结果 (+)： 整个培养基或斜面部分呈现明显的粉红色或紫红色。
- 阴性结果 (-)： 培养基保持原始颜色（通常为黄色或橙黄色）或无明显颜色变化。
- 弱阳性/迟缓阳性： 颜色变化缓慢或不明显，可能需要延长培养时间或结合其他试验判断。
四、 结果判读与注意事项
- 判读时间： 判读时间至关重要。有些细菌（如变形杆菌、摩根菌）能快速水解尿素（通常在4-24小时内产生强阳性反应），而另一些细菌（如某些克雷伯菌属、肠杆菌属菌株）可能反应较慢（需要48小时或更长时间）。
- 假阳性： 可能由以下原因引起：
- 培养基灭菌不彻底或受到污染。
- 接种时带入碱性物质。
- 某些非尿素酶阳性的细菌（如铜绿假单胞菌）在碱性蛋白胨培养基中生长时，可能因分解含氮物质产碱导致颜色变化（但通常不呈均匀粉红色，且不依赖于尿素存在）。
- 培养基中尿素浓度过高或缓冲能力不足。
- 假阴性： 可能由以下原因引起：
- 接种物中细菌数量过少或细菌活性差。
- 培养时间不足（特别是对于慢反应菌株）。
- 培养基中尿素分解（如保存不当、反复冻融、过热）。
- 培养基pH值初始值过高（>7.0），导致指示剂已接近变色边缘。
- 某些尿素酶阳性菌株在特定条件下（如厌氧环境）可能不表达尿素酶。
- 对照试验： 每次试验应同时设立已知阳性菌株（如普通变形杆菌）和已知阴性菌株（如大肠埃希菌）作为对照，以确保培养基和试验条件可靠。
五、 临床意义
尿素酶试验在临床微生物学诊断中具有重要价值：
- 鉴定肠杆菌科细菌：
- 快速强阳性： 是变形杆菌属、摩根菌属和普罗维登斯菌属的典型特征，有助于与其他肠杆菌科细菌（如大肠埃希菌、志贺菌属、沙门菌属通常为阴性）区分。
- 迟缓阳性： 见于某些克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属、枸橼酸杆菌属的菌株。
- 鉴定螺杆菌属： 幽门螺杆菌能产生非常活跃的尿素酶，是诊断胃活检标本中存在幽门螺杆菌的重要依据（如快速脲酶试验，通常在数分钟至数小时内出现强阳性）。
- 鉴定其他细菌： 也可用于鉴定布鲁菌属（通常阳性）、假单胞菌属中的某些种（如洋葱伯克霍尔德菌通常阳性）、耶尔森菌属中的某些种（如小肠结肠炎耶尔森菌某些生物型阳性）以及一些非发酵菌和革兰阳性菌（如解脲棒杆菌、某些葡萄球菌）。
- 区分菌种/生物型： 在相近菌种间有鉴别意义，例如肺炎克雷伯菌通常迟缓阳性，而产酸克雷伯菌通常阴性。
六、 总结
尿素酶试验是一种操作相对简便、成本低廉且结果直观可靠的经典生化试验。它通过检测细菌水解尿素产碱的能力，在临床微生物学实验室中对多种细菌（尤其是肠杆菌科细菌和幽门螺杆菌）的鉴定和区分发挥着不可或缺的作用。准确理解和掌握其原理、操作方法、结果判读要点（特别是判读时间）以及潜在的假阳性和假阴性原因，对于确保试验结果的可靠性至关重要。在实际应用中，应结合菌落形态、革兰染色结果及其他生化试验进行综合判断。