苯丙氨酸脱氨酶试验

苯丙氨酸脱氨酶试验

一、 概述 苯丙氨酸脱氨酶试验（Phenylalanine Deaminase Test）是微生物学中一项重要的生化鉴定试验，主要用于区分肠杆菌科（Enterobacteriaceae）中的某些菌属，特别是用于鉴别变形杆菌属（Proteus）、摩根菌属（Morganella）和普罗威登斯菌属（Providencia）与其他肠杆菌科细菌（如大肠埃希菌、沙门氏菌）。该试验检测细菌是否产生苯丙氨酸脱氨酶。

二、 实验原理

1. 酶的作用： 某些细菌能够产生苯丙氨酸脱氨酶（Phenylalanine Deaminase）。这种酶可以催化苯丙氨酸（一种氨基酸）发生氧化性脱氨反应。
2. 反应过程： 苯丙氨酸在苯丙氨酸脱氨酶的作用下，脱去氨基（-NH₂），生成苯丙酮酸（Phenylpyruvic Acid）和游离的氨（NH₃）。苯丙氨酸 (C₉H₁₁NO₂) + H₂O + O₂ → 苯丙酮酸 (C₉H₈O₃) + NH₃ + H₂O₂
3. 显色反应： 当向含有苯丙酮酸的培养物中加入三氯化铁（FeCl₃）试剂时，苯丙酮酸会与Fe³⁺离子发生螯合作用，形成一种特殊的绿色复合物。
4. 结果判读： 培养物斜面或菌苔变为橄榄绿色至深绿色，即为阳性反应，表明该细菌能产生苯丙氨酸脱氨酶。若斜面颜色无变化（保持试剂本身的浅黄色或培养基颜色），则为阴性反应。

三、 培养基

• 名称： 苯丙氨酸琼脂培养基（Phenylalanine Agar Medium）。
• 基本成分：
  • 酵母提取物：提供生长因子。
  • 氯化钠：维持渗透压。
  • DL-苯丙氨酸（或 L-苯丙氨酸）：提供底物。
  • 磷酸氢二钠：缓冲剂。
  • 琼脂：固化剂。
  • 蒸馏水：溶剂。
  • pH通常调整为7.3 ± 0.1。
• 要求： 培养基斜面应有足够的水分（适度湿润），这有利于生长和反应产物的扩散。

四、 所需试剂

• 10% 三氯化铁（FeCl₃）溶液：
  • 配制：称取10g无水三氯化铁（FeCl₃），溶于100ml蒸馏水中。溶液呈强酸性（淡黄至黄褐色）。
  • 储存： 避光保存于深色玻璃瓶中，临用前配制或检查有无沉淀析出（如有应过滤）。久置可能失效。
  • 安全性： 三氯化铁溶液具有腐蚀性，操作时需戴手套和防护眼镜，避免接触皮肤和衣物。

五、 实验方法

1. 接种：
   • 使用无菌接种针，挑取待测细菌的纯培养菌落。
   • 在苯丙氨酸琼脂斜面上进行划线接种（大面积涂布生长），以增加产生反应产物的量。
2. 培养：
   • 将接种好的斜面置于35 ± 2°C需氧环境中培养18至24小时。某些生长较慢的菌株可能需要培养至48小时。
3. 加试剂：
   • 培养结束后，取出斜面。
   • 向生长良好的菌苔上滴加4至5滴（约0.25ml至0.3ml）10%的三氯化铁试剂。
   • 倾斜试管，让试剂缓慢流过整个菌苔表面，确保试剂与菌苔充分接触。
4. 观察结果：
   • 在滴加试剂后立即（1至5分钟内）观察斜面的颜色变化。
   • 关键： 反应产生的绿色不稳定，会迅速褪色（通常10分钟内），因此必须在加试剂后尽快判读结果。

六、 结果判定

• 阳性（+）： 菌苔及与菌苔接触的培养基立即（通常在1分钟内）出现明显的橄榄绿色至深绿色（翠绿色）。颜色应沿着菌苔蔓延开。这是苯丙酮酸存在的特征表现（如奇异变形杆菌、普通变形杆菌、摩根摩根菌）。
• 阴性（-）： 菌苔和培养基无绿色出现，保持培养基的黄色或三氯化铁试剂本身的浅黄色（如大肠埃希菌、沙门氏菌、志贺氏菌、克雷伯菌属、肠杆菌属）。
• 注意： 任何黄色、褐色或其他非绿色变化均视为阴性结果。

七、 临床意义与用途

• 主要鉴别价值： 该试验是区分变形杆菌属、摩根菌属、普罗威登斯菌属（这三属通常是阳性）与其他大多数肠杆菌科细菌（通常是阴性）的关键试验之一。
• 辅助鉴定：
  • 有助于鉴别变形杆菌属（阳性）与相近的普罗威登斯菌属（通常也是阳性，但部分菌种如产碱普罗威登斯菌可能阴性）/摩根菌属（阳性）。
  • 可用于鉴别肠杆菌科中苯丙氨酸脱氨酶阳性的菌群（变形杆菌族）与阴性菌群。
• 初步筛查： 在肠道病原菌（如沙门氏菌、志贺氏菌）分离鉴定流程中，苯丙氨酸脱氨酶阴性可辅助排除变形杆菌等常见杂菌的干扰。
• 局限性： 该试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。其他菌科或属的细菌很少进行此试验。

八、 质量控制 为保证试验结果的准确性，每次试验或每批新配制/新购的培养基和试剂应使用已知阳性和阴性菌株进行质控：

• 阳性对照菌株： 奇异变形杆菌 (Proteus mirabilis) ATCC 12453 或 29906。
• 阴性对照菌株： 大肠埃希菌 (Escherichia coli) ATCC 25922 或 35218。
• 预期结果： 阳性对照应出现快速、明显的绿色（阳性）；阴性对照应无绿色出现（阴性）。

九、 注意事项

1. 观察及时性： 绿色复合物不稳定，必须在加试剂后立即（1-5分钟内）观察结果，延迟观察会导致假阴性。
2. 试剂有效期： 10% FeCl₃ 溶液易水解产生沉淀或氧化变质，应新鲜配制或检查其有效性。出现大量沉淀或颜色异常加深可能失效。
3. 试剂用量： 需加入足量试剂覆盖整个菌苔。
4. 菌苔量： 足够的菌量是产生足够苯丙酮酸的关键。必须保证菌苔生长浓厚。
5. 培养基水分： 适当湿润的斜面有利于试剂扩散和显色反应。过于干燥的斜面可能影响结果观察。
6. 非特异性反应： 极少数其他代谢产物也可能与FeCl₃产生颜色（如棕色、黄色等），但阳性反应特指快速出现的绿色。
7. 安全：
   • 三氯化铁溶液具有强腐蚀性和酸性，操作需小心，避免接触皮肤、眼睛和衣物。如不慎接触，立即用大量清水冲洗。
   • 苯丙氨酸培养基和废弃物按实验室生物安全规定处理。
8. 结果确认： 生化试验结果应结合其他生化反应、菌落形态、革兰染色等进行综合鉴定。

十、 总结 苯丙氨酸脱氨酶试验操作简便、成本低廉，是临床微生物实验室鉴定肠杆菌科细菌，特别是快速筛选和鉴别变形杆菌族（变形杆菌属、摩根菌属、普罗威登斯菌属）的核心生化试验之一。其原理基于细菌是否产生苯丙氨酸脱氨酶将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸，并通过三氯化铁试剂快速显色（绿色为阳性）进行判断。准确的结果依赖于正确的操作（特别是及时观察）、合格的培养基和试剂、充分的菌苔生长以及严格的质量控制。理解其基本原理和注意事项对于正确应用和解读该试验结果至关重要。