吲哚试验（靛基质试验） - 中析研究所生物检测中心

吲哚试验（靛基质试验）详解：原理、操作与临床意义

吲哚试验，亦称靛基质试验，是微生物学鉴定中一项经典且至关重要的生化试验，主要用于鉴别细菌分解色氨酸生成吲哚的能力。此项测试操作简便、结果可靠，是肠道菌群及其他常见病原菌鉴定的关键步骤。

一、试验目的

检测细菌是否具备色氨酸酶（Tryptophanase），能否水解培养基中的色氨酸产生吲哚（靛基质）、丙酮酸和氨。

二、核心原理

底物分解： 部分细菌能分泌色氨酸酶，将培养基所含的色氨酸水解为：
- 吲哚（靛基质）（主要检测产物）
- 丙酮酸
- 氨（NH₃）
显色反应： 向培养后的培养基中加入特定的吲哚试剂（如 Kovacs 试剂或 Ehrlich 试剂）。
颜色形成： 试剂中的对二甲基氨基苯甲醛（p-Dimethylaminobenzaldehyde）与吲哚在强酸环境下发生缩合反应，生成一种肉眼可见的 玫瑰红色至樱桃红色化合物（对二甲基氨基苯甲醛吲哚复合物）。该复合物可溶于试剂中的有机溶剂（如戊醇、异戊醇、二甲苯），并聚集在培养基表面呈现明显红色环。

三、所需试剂

培养基： 富含色氨酸的蛋白胨水培养基是其常用培养基（如色氨酸肉汤或胰蛋白胨水培养基）。蛋白胨质量直接决定色氨酸含量，影响试验准确性。
吲哚试剂：
- Kovacs 试剂（常用）： 含戊醇或二甲苯、浓盐酸、对二甲基氨基苯甲醛。加入后需充分摇动。
- Ehrlich 试剂： 含无水乙醇、对二甲基氨基苯甲醛、浓盐酸（通常在使用时才加入）。需沿管壁缓慢加入，避免剧烈混合。
- 重要警示： 试剂含浓盐酸及有机溶剂（二甲苯属易燃物），配制及使用务必在通风环境进行，穿戴防护装备（手套、护目镜、防护服），远离火源。

四、标准操作流程

接种培养：
- 使用纯培养的待测菌株接种富含色氨酸的液体培养基。
- 推荐接种方式：取单个菌落或纯菌培养物穿刺接种或混匀接种。
- 培养条件：通常需在 35-37°C 有氧环境培养 18-24 小时。部分吲哚产生缓慢的菌株需延长至 48 小时。
添加试剂：
- 培养结束后，向培养物中添加约 0.5 mL Kovacs 试剂或 Ehrlich 试剂。
混合与静置：
- Kovacs 试剂： 加完后立即垂直手持试管轻摇数秒，促使试剂与培养物充分接触，静置 1 - 2 分钟待分层。
- Ehrlich 试剂： 沿管壁缓慢加入，避免剧烈混合，静置数分钟待分层。
结果判读：
- 阳性结果（+）： 试剂层（上层）呈现清晰明亮的 玫瑰红色至樱桃红色环。
- 阴性结果（-）： 试剂层保持试剂原有色泽（通常为淡黄色或琥珀色），未出现红色环。培养物可能呈黄色或浑浊。

结果示例图: [图示描述：左侧试管显示培养基分层，上层试剂为鲜明红色（阳性）；右侧试管上层试剂为黄色/琥珀色（阴性）]

五、质量控制

阳性对照菌株： 大肠埃希菌（Escherichia coli） - 应产生强阳性结果（鲜红色环）。
阴性对照菌株： 产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）或肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae） - 应保持阴性结果（无红色环）。
培养基质控： 定期使用对照菌株验证培养基效能。
试剂质控： 新配试剂需用已知阳性和阴性菌株验证有效性。

六、临床及分类学意义

吲哚试验是肠杆菌科细菌鉴别的基石之一：

典型阳性菌： 大肠埃希菌（E. coli）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、摩氏摩根菌（Morganella morganii）、产吲哚金黄杆菌（Chryseobacterium indologenes）。
典型阴性菌： 肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）、产气肠杆菌（E. aerogenes）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）、伤寒沙门菌（Salmonella Typhi）、弗氏志贺菌（Shigella flexneri）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

其在微生物鉴定系统中的关键作用：

属间鉴别： 如大肠埃希菌（+）与克雷伯菌属（-）、肠杆菌属（-）。
种间鉴别： 如普通变形杆菌（+）与奇异变形杆菌（-）；摩氏摩根菌（+）与雷极普罗威登斯菌（通常-）；霍乱弧菌（+）与拟态弧菌（通常-）。
种内鉴别： 某些菌种（如柠檬酸杆菌属、爱德华菌属、蜂房哈夫尼亚菌）存在吲哚阳性与阴性菌株，需结合其他试验鉴别。

七、关键注意事项与局限性

培养时间： 培养时长直接影响结果准确性。培养不足易致假阴性；培养过长（>48小时）可能因细菌耗尽吲哚而产生假阴性。
试剂敏感性： Ehrlich 试剂灵敏度通常高于 Kovacs 试剂，尤其适用于吲哚产量低的菌株（如某些弧菌、嗜血杆菌）。
试剂添加量： 过量试剂可能稀释吲哚导致假阴性；不足则无法充分反应导致假阴性或结果模糊。
培养基成分： 培养基色氨酸含量不足（如劣质蛋白胨）易导致假阴性。
吲哚挥发性： 吲哚具挥发性，培养后应尽快检测，避免因挥发造成假阴性。
强还原环境： 培养基存在强还原物质可能抑制吲哚产生或干扰显色。
非发酵菌应用： 部分非发酵菌（如产吲哚金黄杆菌）亦可通过此试验鉴定。
安全性： 严格遵守试剂安全操作规程，防范腐蚀与火灾风险。

结论

吲哚试验以其明确的原理、简便的操作和高度的可靠性，在临床微生物实验室常规鉴定（尤其肠杆菌科和弧菌科）中发挥着不可替代的作用。正确理解其操作方法、结果判读要点及潜在影响因素，是获取准确鉴定结果、保障感染性疾病精准诊疗的关键环节。此试验常与其他关键生化试验（如 MR、VP、枸橼酸盐利用试验）联合构成完整的鉴定体系（如经典的 IMViC 试验）。

进一步探讨：